Разработка и поиск эффективных препаратов для профилактики и лечения вирусных инфекций является одной из актуальных задач современной фармацевтической промышленности. В связи с тем, что антибиотики малоэффективны при вирусных заболеваниях, потребность в новых средствах очень высока. В последние годы повысился интерес к лекарственным средствам растительного происхождения. В ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» ведется поиск и разработка новых лекарственных препаратов, как на основе плодовых тел, так и культивируемого мицелия некоторых грибов. Так, предложен ингибитор репродукции вируса иммунодефицита человека первого типа, содержащий водный или водно-спиртовый экстракт природных биологически активных веществ из базидиального гриба Inonotus obliquus (патент РФ № 2375073). Показана высокая вируснейтрализующая активность в отношении вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) и высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) некоторых гастероидных грибов: Lycoperdon perlatum (дождевик жемчужный), Dictyophora duplicatа (диктиофора сдвоенная), Calvatia lilacina (головач сиреневатый) и Lycoperdon umbrinum (дождевик умбровый) [1]. Высшие базидиомицеты, как источники различных БАВ, обладающих высокой фармакологической активностью, низкой токсичностью при практически полном отсутствии побочных эффектов, вызывают вполне логичный интерес у исследователей, разрабатывающих новые лекарственные средства. Ранее было показано, что трутовик настоящий - Fomes fomentarius, относящийся к семейству Polyporaceae, обладает широким спектром биологических активностей: противоопухолевой, иммуномодулирующей, антиоксидантной [6]. Полисахариды, выделенные из культивированного мицелия Fomes fomentarius, оказывают антипролиферативное воздействие in vitro на клетки рака желудка [4], а водный экстракт гриба нормализует уровень глюкозы в крови и липидный обмен, а также снижает активность ферментов супероксиддисмутазы и каталазы, стимулирует тканевое дыхание. В Японии и Корее экстракт трутовика настоящего в сочетании с лекарственными растениями применяют в составе функциональных напитков для профилактики раковых заболеваний и диабета, для лечения нервных заболеваний и нормализации состава крови [5]. Однако наиболее перспективными для приготовления различных лекарственных форм могут стать сухие экстракты Fomes fomentarius. В связи с этим задачей настоящего исследования явилось изучение химического состава и разработка технологии приготовления сухого экстракта из гриба Fomes fomentarius.
Материалы и методы
Объектом исследования служили плодовые тела Fomes fomentarius, собранные в августе 2011 г. в Караканском бору на территории Ордынского района Новосибирской области. Плодовые тела высушивали до воздушно-сухого состояния, упаковывали в бумажные мешки и хранили в сухом прохладном месте. Собранное сырье было использовано для проведения химических и технологических исследований.
Извлечение БАВ из плодовых тел гриба проводили различными методами: перколяцией, мацерацией и дробной мацерацией с использованием в качестве экстрагентов воды и спирта этилового различной концентрации.
Содержание БАВ в сырье определяли в пересчете на абсолютно сухое сырье. Определение суммы экстрактивных веществ проводили по методике ГФ XI изд., вып.2. Для качественного обнаружения флавоноидных соединений в экстрактах гриба применяли качественные реакции с раствором натрия гидроксида, алюминия хлорида, железа хлорида, а также метод ТСХ. Обнаружение кумаринов проводили с помощью лактонной пробы, основанной на способности лактонного кольца размыкаться при подщелачивании и замыкаться в кислой среде. Оценку наличия сапонинов проводили по реакции пенообразования. Количественное содержание белка в образцах определяли с помощью красителя кумассиG-250, по Бредфорд, с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта [3]. Суммарное содержание полисахаридов определяли спектрофотометрически модифицированным антроновым методом Дрейвуда [2], включающим кислотный гидролиз полисахаридов серной кислотой с получением моносахаридов, образующих с антроном окрашенные комплексы сине-зеленого цвета с максимумом спектра поглощения при 520-625 нм. При разбавлении реакционной смеси этиловым спиртом максимум спектра поглощения смещается до 430 нм. Определение содержания полисахаридов проводили в пересчете на глюкозу, используя предварительно построенный калибровочный график зависимости величины оптической плотности глюкозы (λ=430 нм) от концентрации. В работе использовали спектрофотометр SmartSpecPlus.
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с помощью пакета компьютерных программ анализа данных MicrosoftExcel.
Результаты и обсуждение
Учитывая, что гриб Fomes fomentarius содержит комплекс биологически активных веществ, обеспечивающих различные биологические активности, необходимо было разработать рациональную технологию полноценного извлечения действующих веществ из сырья. Одним из самых распространенных и чаще других используемых методов выделения БАВ является экстракция. Для проведения процесса экстракции важен выбор экстрагента и режим экстрагирования БАВ, поскольку основными факторами, влияющими на скорость и полноту экстракции биологически активных веществ из грибов, являются тип экстрагента, продолжительность экстракции, температура, степень измельченности сырья. Оценку результатов проводили по экстрактивным веществам. Для выделения БАВ из F. fomentarius использовали как статические, так и динамические методы экстракции: мацерацию, дробную мацерацию и перколяцию. Экстрагирование перколяцией осуществляли до полного истощения сырья, определяемого визуально по обесцвечиванию извлечения. Процесс ремацерации проводили в три стадии настаивания при температуре 55-60 °С при соотношении сырья и экстрагента 1:12 на первой стадии, 1:10 на второй и 1:8 на третьей стадиях. Общее время экстракции 19 час. Для повышения эффективности экстракции биологически активных веществ из сырья применяли сверхвысокочастотную обработку (СВЧ). После охлаждения полученные экстракты фильтровали через бумажный фильтр, выпаривали на лабораторном вакуумном испарителе и высушивали в сушильном шкафу при температуре 60 °С. Полученный экстракт представляет собой аморфный мелко-дисперсный порошок коричневого цвета со специфическим запахом и содержанием влаги 4,6 %, гигроскопичен.
Для выбора оптимального экстрагента с целью получения максимального извлечения всех групп БАВ из Fomes fomentarius были изучены следующие экстрагенты: вода, спирт этиловый 40 %, 60 %, 70 % и 80 %. Показано, что при проведении процесса ремацерации выход экстрактивных веществ во всех извлечениях был достаточно высок для сырья природного происхождения и составлял от 1,4 до 5,0 %. Следует отметить, что максимальное содержание экстрактивных веществ (5,6 ± 0,7) % выявлено в экстрактах, полученных с использованием спирта 70 % , минимальное содержание (1,2 ± 0,3) % - при использовании в качестве экстрагента воды.
Поскольку для интенсификации процесса экстрагирования важна степень измельченности сырья, проведена оценка выхода экстрактивных веществ в зависимости от размера частиц плодового тела гриба Fomes fomentarius. Проведенные исследования позволили выбрать оптимальную степень измельченности гриба - наиболее полное извлечения БАВ наблюдалось для частиц размером от 50 до 500 мкм. Варьируя температуру экстрагирования от 20 до 80 °С, установлена оптимальная температура процесса, которая составила 55-60 °С. Включение в технологический процесс СВЧ нагрев на стадии экстрагирования позволило сократить время экстракции в 1,5 раза без снижения выхода экстрактивных веществ.
Изучение химического состава полученного сухого экстракта подтвердило наличие в данном грибе разнообразных БАВ, таких как белки и полисахариды, сапонины тритерпеновой группы, кумарины, фенольные соединения. Интерес представляет изучение полисахаридов и белков, так как именно с этими группами соединений связывают фармакологическое действие экстракта. Показано, что содержание белков в сухом экстракте из плодового тела гриба Fomes fomentarius находилось в пределах от 7,0 до 8,4 % , полисахаридов от 53,2 до 68,2 %.
Выводы
Установлены оптимальные значения технологических параметров процесса получения сухого экстракта из гриба Fomes fomentarius методом ремацерации. Проведен качественный и количественный анализ БАВ, содержащихся в сухом экстракте, выявлены ведущие группы биологически активных веществ для последующей стандартизации экстракта.
Рецензенты:
- Теплякова Тамара Владимировна, доктор биологических наук, профессор, заведующая сектором микологии ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово, Новосибирская обл.
- Белявская Валентина Александровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями ООИ ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п.Кольцово, Новосибирская обл.
Библиографическая ссылка
Трошкова Г.П., Костина Н.Е., Проценко М.А., Скарнович М.А. ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ЭКСТРАКТА ИЗ ГРИБА FOMES FOMENTARIUS // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 4. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=6885 (дата обращения: 20.04.2024).