Одним из наиболее перспективных видов лекарственного растительного сырья (ЛРС) для внедрения в клиническую практику при заболеваниях суставов, является кора различных видов ивы [5]. Данное растение весьма распространено на территории Европейской части Российской Федерации (произрастает более 80 видов) [2]. Этот факт повышает актуальность изучения его фармакологических свойств. В Северо-Кавказском регионе произрастает около 20 видов ивы. Нами выбраны для изучения побеги ивы трехтычинковой (SalixtriandraL.), имеющей один из лучших показателей продуктивности при культивировании в районе Кубано-Приазовской низменности [6].
В настоящее время наметилась тенденция роста производства лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе измельченного нативного лекарственного сырья. Эта древнейшая и самая простая лекарственная форма привлекает исследователей своей биодоступностью, низкой токсичностью и удобством применения [1]. В связи с этим актуально определение технологических свойств порошка побегов ивы трехтычинковой, влияющих на процесс объемного дозирования полученного готового продукта – порошка растения – на фармацевтическом производстве.
Цель работы: изучить противовоспалительную активность и ульцерогенное действие порошка побегов ивы трехтычинковой, а также его технологические характеристики, влияющие на получение потенциального лекарственного средства.
Материалы и методы исследования.
Исследование проводили на образцах побегов ивы трехтычинковой, собранных в г. Пятигорске Ставропольского края в пойме реки Подкумок в конце мая 2014 года. В качестве сырья заготавливали только молодые (текущего года) облиственные, неодревесневшие побеги.Для измельчения побегов ивы, имеющих волокнистую структуру, была применена траворезка, с помощью которой достигали размера частиц 3 мм. Дальнейшее измельчение сырья до размера частиц менее 1 мм (оптимального для приема внутрь) проводили на мельнице с ротационным ножом. Стандартного состояния измельченного сырья достигали просеиванием через сито соответствующего диаметра. Очистку от пыли осуществляли просеиванием через сито с размером отверстий 0,2 мм.
Из измельченных побегов ивы трёхтычинковой и коры ивы белой, взятой в качестве препарата сравнения [4], готовили суспензии, используя в качестве растворителя воду очищенную. Для устойчивости суспензии порошок ЛРС растирали с 1-2 каплями Твина-80, а затем порциями воды очищенной порошок из побегов и коры количественно переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили водой очищенной до метки. Рассчитанное количество действующего вещества для крысы массой 200 г. содержалось в 2 мл суспензии. Исследуемые объекты вводились в дозе 68 мг/кг (соответствует приему человеком, массой 70 кг, 800 мг порошка в сутки).
Кора ивы является известным источником «природных салицилатов» (преобладает фенольный гликозид салицин), поэтому кроме порошка коры ивы белой препаратом сравнения являлась и ацетилсалициловая кислота (АСК) в дозе 125 мг/кг, соответствующей приему человеком, массой 70 кг, 1,5 г АСК в сутки. Вещество также вводилось в виде водной суспензии на Твине-80 в объеме 2 мл.
Изучаемые измельченные побеги ивы трехтычинковой и кора ивы белой, а также препарат сравнения в эквивалентном объеме вводили с помощью зонда в желудок в течение 7 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор таким же способом [7].
Оценку противовоспалительной активности проводили на модели ватной гранулемы (хроническое пролиферативное воспаление) [9]. Для проведения эксперимента было использовано 4 группы животных по 6 особей в каждой (крысы-самцы линии Wistar весом 220-240 г). Животные первой группы служили контролем, второй получали суспензию порошка побегов ивы трёхтычинковой, третьей – суспензию порошка коры ивы белой; четвертой – суспензию АСК. Во время эксперимента животные содержались в стандартных условиях вивария ПМФИ на пищевом рационе со свободным доступом к корму и воде, находящейся в стандартных питьевых бутылочках.
У белых наркотизированных крыс (хлоралгидрат в дозе 350 мг/кг) в области спины выстригалась шерсть. В асептических условиях ножницами делался разрез кожи и подкожной клетчатки длиной около 1 см. Пинцетом в подкожной клетчатке через разрез формировалась полость, куда помещался простерилизованный ватный шарик с точной массой 15 мг. На полученную рану накладывалось два шва. Через 7 дней (на восьмые сутки) эксперимента имплантированный шарик с образовавшейся вокруг него грануляционной тканью извлекался, взвешивался, затем высушивался до постоянной массы при 60-65оС. Величину экссудативной фазы воспаления рассчитывали по разнице в массе (мг) шарика до и после высушивания, а величину пролиферативной фазы устанавливали по разнице в массе (мг) высушенного шарика с его исходной массой 15 мг.
Результаты опытов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.
Следующим этапом наших исследований было определение ульцерогенного действия (наиболее характерный для противовоспалительных лекарственных препаратов побочный эффект). Поскольку исследуемые объекты вводились испытуемым животным в течение 7 дней, данный эксперимент можно считать субхроническим введением.
С целью изучения ульцерогенного действия порошка побегов ивы трёхтычинковой опытных животных декапитировали под хлоралгидратным наркозом, извлекали желудки, рассекали по малой кривизне и промывали в 0,9% физиологическом растворе для удаления содержимого и оценивали степень влияния исследуемых веществ на слизистую оболочку. Степень повреждения желудка оценивали в баллах: 0 баллов – отсутствие повреждений, 1 балл – единичные незначительные повреждения (1 или 2 точечных кровоизлияния); 2 балла – множественные повреждения (эрозии, точечные кровоизлияния); 3 балла – значительные и множественные повреждения слизистой оболочки; 4 балла – грубые повреждения, охватывающие всю поверхность слизистой оболочки (массивные кровоизлияния, эрозии, перфорации). Кроме того, симптомы, предшествующие образованию деструкции в желудке и указывающие на определённые трофические нарушения в его слизистой (отёк, гиперемия, инъекция сосудов, кровоизлияния), оценивали в 0,5 балла.
Определение технологических характеристик. Наиболее быстрым и удобным методом определения фракционного состава является ситовой анализ. Определение фракционного состава проводили согласно методике ОФС 42-0136-09 «Ситовой анализ» Государственной Фармакопеи РФ XII издания.
Определение степени сыпучести порошков и насыпного объема проводили в соответствии с ОФС 42-0137-09 «Степень сыпучести порошков» Государственной Фармакопеи РФ XII издания.
Условно принята следующая характеристика порошкообразных веществ по их сыпучести: отличная (8,6-12,0 г/с), хорошая (6,6-8,5 г/с), удовлетворительная (3-6,5 г/с), допустимая (2,-3 г/с), плохая (1-2 г/с), очень плохая (<1г/с).
Насыпная плотность – определяется отношением массы свободно насыпанного материала к занимаемому им объему, выражается в кг/м3 и рассчитывается по формуле (3):
. (3)
В зависимости от значения насыпной плотности порошкообразные вещества условно подразделяют на весьма тяжелые (rн>2000 кг/м3), тяжелые (rн>1100 кг/м3), средние (rн>600 кг/м3), легкие (rн<600 кг/м3).
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке противовоспалительного действия испытуемых объектов получены следующие данные (табл.1).
Таблица 1
Результаты определения противовоспалительной и ульцерогенной активности порошка побегов ивы трехтычинковой и коры ивы белой в сравнении с ацетилсалициловой кислотой
Объект |
Противовоспалительная активность |
Ульцерогенная активность (баллы) |
|
Экссудация, мг |
Пролиферация, мг |
||
Контроль |
200,0±10,50 |
34,2±2,23 |
0 |
АСК, 125 мг/кг |
116,53±8,00 |
24,71±1,53 |
3,8±0,134* |
Побеги ивы, 68 мг/кг |
118,6±8,87* -41% |
22,4±2,18* -35% |
0,3±0,023*#
|
Кора ивы, 68 мг/кг |
125,2±16,14* -37% |
27,2±5,26 |
0,6±0,0047*# |
Примечание: *- достоверно по отношению к контролю, #-достоверно по отношению к АСК |
Как следует из экспериментальных данных, порошки, полученные из коры ивы трехтычинковой и побегов ивы белой, достоверно уменьшили экссудацию по сравнению с контрольной группой на 41% и 37 % соответственно. Сравнение этого показателя не выявило достоверных отличий порошка коры ивы белой и побегов ивы трехтычинковой от препарата сравнения – АСК. По ограничению экссудации порошок побегов ивы также достоверно не отличался от порошка коры ивы, хотя последний и проявил большую антиэкссудативную активность.
Анализ влияния объектов исследования на пролиферативную стадию воспаления показал, что порошок коры ивы белой достоверно угнетает образование грануляционной ткани на 35 % по отношению к контрольной группе. Порошок побегов ивы трехтычинковой хотя и снижал уровень пролиферации на 20%, но эти данные были недостоверными (нет достоверных отличий от контрольной группы животных). Сравнение этого показателя для порошка коры ивы не выявило достоверных отличий от АСК.
Таким образом, в опытах на крысах на модели хронического пролиферативного воспаления (ватной гранулемы) измельченный порошок побегов ивы трехтычинковой в эффективной дозе 68 мг/кг обладает достоверной антиэкссудативной и антипролиферативной активностью сопоставимой с лекарственным средством АСК.Выявленные эффекты порошков коры и побегов ивы трёхтычинковой способствуют регенерации тканей в очаге воспаления.
При оценке ульцерогенного действия выявлено, что в дозе 125 мг/кг АСК вызывала повреждение слизистой желудка у 90-100% животных, степень повреждения слизистой оболочки желудка составила 3,8 балла. АСК в дозе 125 мг/кг вызывала слущивание клеток эпителия, геморрагическое воспаление слизистой оболочки желудка. Минимальная степень повреждения наблюдалась при применении суспензии, полученной из побегов ивы трехтычинковой (0,3 балла). Слабое ульцерогенное действие (0,6) проявилось и под влиянием коры ивы белой (наблюдалась лёгкая гиперемия).
Исследования по определению технологических свойств порошка побегов ивы трехтычинковой касались изучения некоторых факторов, влияющих на процесс объемного дозирования (фракционного состава, насыпной плотности и сыпучести) [8].
Фракционный состав или распределение частиц порошкообразного вещества по размерам, оказывает значительное влияние на стабильность порошкованной массы и ритмичную работу дозирующей машины. Наиболее быстрым и удобным методом определения фракционного состава является ситовой анализ. Определено, что порошок ивы трехтычинковой побегов неоднороден, в нем преобладают фракции с размером частиц более 1 мм (35,5%) и с размером частиц 0,5-1 мм (31,1%).
Обеспечение выполнения одного из основных требований к качеству порошка – однородности дозирования – зависит от сыпучести материала. Сыпучесть (текучесть) – способность порошкообразного вещества высыпаться под силой собственной тяжести и обеспечивать равномерное заполнение матричного канала. Сыпучесть является комплексной характеристикой ряда физико-химических свойств веществ, таких как – форма и плотность частиц, влажность, гигроскопичность и др. Исходя из расчетных данных, представленных в таблице 2, все фракции порошка ивы трехтычинковой побегов обладают хорошей сыпучестью.
Таблица 2
Результаты определения фракционного состава, сыпучести и насыпной плотности порошка побегов ивы трехтычинковой
Наименование показателя |
Размер фракции порошка, мм |
|||
более 1,0 |
от 0,5 до 1,0 |
от 0,25 до 0,5 |
менее 0,25 |
|
Mасса фракции порошка, г |
53,25 |
46,65 |
44,85 |
5,25 |
Состав фракции порошка, % |
35,5 |
31,1 |
29,9 |
3,5 |
Сыпучесть, г/с |
5,9 |
6,6 |
8,5 |
8,9 |
Насыпная плотность, г/см3 |
0,399 |
0,530 |
0,328 |
0,322 |
Насыпная плотность зависит от формы, размера частиц и влажности порошкообразных веществ. Насыпная плотность была определена у каждой фракции (табл.2). Результаты исследования насыпной плотности показали, что все фракции порошка ивы трехтычинковой побегов можно условно отнести к легким порошкам.
Результаты технологических исследований свидетельствуют о возможности непосредственного объемного дозирования порошка побегов ивы трехтычинковой при производстве потенциального лекарственного препарата.
Заключение:
1. Измельченные порошки побегов ивы трехтычинковой и коры ивы белой в эффективной дозе 68 мг/кг в экспериментах на крысах линии Wistar на модели хронического пролиферативного воспаления обладают достоверной антиэкссудативной и антипролиферативной активностью сравнимой с лекарственным средством кислотой ацетилсалициловой.
2. Определены технологические характеристики (фракционный состав, насыпная плотность и сыпучесть) порошка побегов ивы трехтычинковой, которые свидетельствуют о возможности его объемного дозирования на фармацевтических производствах.
3. Результаты исследования свидетельствуют о перспективности дальнейшего всестороннего изучения растительного сырья различных видов ивы с целью последующего внедрения в медицинскую практику.
Рецензенты:Погорелый В.Е.,д.б.н.,профессор,профессор кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии,Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пятигорск;
Доркина Е.Г., д.б.н., доцент,заведующая кафедрой биологической химии и микробиологии, Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Пятигорск.