Взаимодействие живых организмов с факторами окружающей среды в настоящее время интенсивно изучается при анализе механизмов адаптации. Динамические перестройки на различных уровнях организации организмов способствуют приспособлению животных к урбанизированным условиям обитания [6].
Целью настоящего исследования явилось изучение адаптивных перестроек нейрон-глиальных популяций VI слоя крыши среднего мозга остромордой лягушки (Ranaarvalis), обитающей на территории южной части Красноярского края с разным уровнем антропогенного воздействия.
Материалы и методы
Исследования проведены на остромордых лягушках (R. arvalis), отловленных в мае-июне 2008–2010 гг. из биотопов Красноярского края, отличающихся степенью урбанизации и уровнем загрязнения окружающей среды. Всего исследовано 37 амфибий.
Забор материала осуществлялся в соответствии с приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23.08.2010 № 708н г. Москва «Об утверждении правил лабораторной практики». Изъятый мозг фиксировали по стандартной гистологической методике для нервной ткани с последующим изготовлением серийных срезов на санном микротоме «Slide 2002». Готовые срезы, толщиной 5–7 мкм, окрашивали на выявление рибонуклеопротеидных комплексов тионином по Нисслю в модификации И.В. Викторова [2] и на содержание общего белка амидочерным (АЧ 10Б) [4].
Крыша среднего мозга земноводных, tectumopticum, состоит из поверхностного, центрального и перивентрикулярного слоев. Последние два слоя (центральный и перивентрикулярный) объединяются в так называемое центральное серое вещество, в котором выделяют 9 слоев. В перивентрикулярный слой входят 1–6 слои крыши среднего мозга [7]. В данной работе изучены эфферентные нейроны VI (наружного зернистого) слоя крыши среднего мозга земноводных, идентичные IV слою крыши среднего мозга костных рыб. Средний мозг является высшим интегрирующим центром и обеспечивает регуляцию и координацию движений амфибий. Дифференцировку структур проводили по атласам мозга земноводных [10]. Изучены следующие характеристики клеток: площадь сечения тела (Sт), ядра (Sя) и цитоплазмы (Sц) клеток, плотность распределения нейронов и глиоцитов на единицу фиксированной площади (1 мм2), подсчитано число нейронов с разной степенью хроматофилии цитоплазмы: нормохромные, гипохромные и гиперхромные [5]. На препаратах, окрашенных амидочерным 10Б, с помощью микроскопа Zeiss Axioskop со встроенной видеокамерой и прилагаемым программным обеспечением, в нейронах VI слоя крыши среднего мозга количественными методами определено суммарное содержание и концентрация общих водонерастворимых белков, составляющих основу сухого веса клеточных структур [8]. Полученные результаты обработаны непараметрическим критерием Ньюмана – Кейлса. Значимыми принимали значения при р < 0,05. Статистические данные представлены в виде Ме [25 %; 75 %].
Результаты исследования
На основании анализа Государственных докладов «О состоянии и охране окружающей среды в Красноярском крае» за 2008–2011 гг. и типизации урбанистического градиента В.Л. Вершинина [6], районы выборки амфибий подразделены на три группы: 1 – районы с низким уровнем загрязнения (Абанский район, группа 2 и 3); 2 – районы с повышенным уровнем загрязнения (Шарыповский район, группа 5); 3 – районы с высоким уровнем загрязнения (Березовский и Канский районы, группа 1 и 2). Подразделение районов на группы осуществлялось на основании данных о количестве выбросов загрязняющих веществ в атмосферу, уровне загрязнения воды в водоемах, загрязнению почвы, доли интенсивно эксплуатируемых земель, платы за негативное влияние на природу по районам края и степени освоенности территории человеком [3].
Ответная реакция нейронов на патологические экзо- и эндогенные воздействия проявляется увеличением их площади, округлением сомы и ядер клеток, вздутием, укорочением отростков, поражением нейронов по типу центрального хроматолиза [9]. В нашем исследовании сопоставление средних значений площади профильного поля Sт клеток VI слоя крыши среднего мозга Rana arvalis позволило выявить в исследуемых биотопах вариабельность показателей в определенном диапазоне значений от 16,2 мкм2 до 14,8 мкм2. Самые крупные нейроны выявлены в VI слое у остромордой лягушки из поймы р. Берешь Шарыповского района (биотоп 5), близкие к ним показатели были в популяции лягушек1 биотопа. Самые мелкие клетки отмечались в популяции у земноводных 4 биотопа (пруд Егоровка Абанского района). Промежуточное положение занимали показатели Sт нейронов R. arvalis из 2 биотопа (таблица 1). Наличие в популяции нейронов VI слоя R. arvalis разных биотопов клеток с крупными и мелкими размерами свидетельствует либо о набухании нейронов, приводящем к увеличению их Sт, либо уменьшению размеров вследствие истощения, дистрофии и угнетения пластического обмена под действием факторов среды.
Таблица 1
Морфологические характеристики нейронных популяций VI слоя крыши среднего мозга остромордой лягушки (R. arvalis)
|
Показатель Биотоп |
Площадь тела, Sт |
Площадь ядра, Sя |
Площадь цитоплазмы, Sц |
Структурный ядерно-цитоплазматический коэффициент, сЯЦК |
|
Мe [25%; 75%], мкм2 |
||||
|
1 – р. Березовка, Березовский р-н |
16,0 [14,2; 18,5] |
9,3 [8,1; 11,3] |
6,5 [5,8; 7,4] |
1,4 [1,3; 1,6] |
|
2 – искусственный пруд Канский р-н |
15,5 [13,6; 17,3] |
9,6 [8,4; 11,0] |
5,8 [5,3; 6,5] |
1,6 [1,5; 1,8] |
|
p = 0,15 |
p = 0,82 |
p = 0,0001 |
p = 0,0001 |
|
|
3 – пруд Татанщик Абанский р-н |
14,9 [12,9; 17,0] |
9,2 [7,9; 10,4] |
5,6 [5,0; 6,5] |
1,6 [1,4; 1,8] |
|
р3,1 = 0,97 р3,2 = 0,15 |
p3,1 = 0,24 p3,2= 0,32 |
p3,1 = 0,01 p3,2 = 0,042 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,5 |
|
|
4 – пруд Егоровка Абанский р-н |
14,8 [12,2; 17,2] |
9,2 [7,2; 10,8] |
5,8 [5,1; 6,5] |
1,6 [1,4; 1,7] |
|
р4,1 = 0,0002 р4,2 = 0,008 р4,3 = 0,0002 |
p4,1 = 0,01 p4,2 = 0,0029 p4,3 = 0,0003 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,15 p4,3 = 0,001 |
p4,1 = 0,034 p4,2 = 0,0016 p4,3 = 0,02 |
|
|
5 – пойма р. Берешь Шарыповский р-н |
16,2 [13,4; 18,8] |
9,8 [8,2; 12,5] |
6,0 [5,1; 6,7] |
1,7 [1,5; 2,0] |
|
р5,1 = 0,75 р5,2 = 0,3 р5,3= 0,75 р5,4 = 0,0007 |
p5,1 = 0,19 p5,2 = 0,2 p5,3 = 0,8 p5,4 = 0,0002 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,71 p5,3 = 0,1 p5,4= 0,072 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,067 p5,3 = 0,03 p5,4 = 0,0001 |
|
Примечание: значимость различий по сравнению с показателями особей биотопа 1 – 5 (критерий Ньюмана – Кейлса)
У особей во всех изученных биотопах площадь ядра превышала значения цитоплазмы, поэтому с ЯЦК имел значения больше единицы. У земноводных биотопов 3 и 4 ядра нейронов меньше, чем в клетках лягушек 1, 2, 5 биотопов. Вариабельность линейных параметров (Sт, Sц и Sя) нейронов у R. arvalis исследуемых биотопов связана с реактивностью клеток, направленной на адаптацию функционирования и поддержания постоянства внутренней среды у лягушек, обитающих на территории с повышенным и высоким уровнем загрязнения среды (таблица 1).
Вещество Ниссля в нервных клетках является наилучшим индикатором для оценки их функционального состояния при воздействии факторов среды. В популяциях VI слоя во всех биотопах у R. arvalis преобладали нормохромные клетки. Значения показателя варьировали в близких пределах: от 58,6 до 68,7. В наших исследованиях, как и работах других авторов [9], достоверно доказано, что при действии неблагоприятных факторов уменьшается число нормохромных клеток и увеличивается число гипо- и гиперхромных нейронов (таблица 2).
Таблица 2
Соотношение клеток VI слоя крыши среднего мозга остромордой лягушки (Ranaarvalis) по оценке базофильной субстанции
|
Показатель Биотоп |
Нормохромные |
Гипохромные |
Гиперхромные |
|
Мe [25 %; 75 %], % |
|||
|
1 – р. Березовка, Березовский р-н |
58,6 [55,0; 68,0] |
10,5 [8,6; 13,6] |
23,5 [18,2; 27,8] |
|
2 – искусственный пруд Канский р-н |
58,8 [52,4; 65,0] |
11,1 [8,3; 14,3] |
26,8 [21,7; 33,3] |
|
p = 0,0001 |
p = 0,0001 |
p = 0,0001 |
|
|
3 – пруд Татанщик Абанский р-н |
68,7[62,5; 76,2] |
15,4 [11,1; 19,3] |
20,0 [16,1; 23,3] |
|
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,016 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1= 0,001 p3,2 = 0,0001 |
|
|
4 – пруд Егоровка Абанский р-н |
66,7 [57,7; 73,1] |
15,5 [12,0; 20,0] |
23,3 [16,7; 26,3] |
|
p4,1 =0,0002 p4,2 = 0,0005 p4,3 = 0,06 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,7 |
p4,1 = 0,41 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,006 |
|
|
5 – пойма р. Берешь Шарыповский р-н |
61,1 [56,0; 67,7] |
14,3 [11,1; 20,0] |
23,3 [18,2; 28,6] |
|
p5,1 = 0,69 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,0005 |
p5,1 = 0,98 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,0001 |
p5,1 = 0,8 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,002 p5,4 = 0,41 |
|
Примечание: значимость различий по сравнению с показателями особей биотопа 1–5 (критерий Ньюмана – Кейлса).
В биотопах 1, 2 в клетках VI слоя наблюдается незначительное нарастание в популяции гиперхромных клеток, накапливающих рибонуклеопротеидные комплексы, что указывает на интенсификацию адаптационных механизмов и создание запаса белкового фонда в клетке. Появление в небольшом соотношении гипохромных, активно работающих нейронов, указывает на активацию клеточных популяций и интенсивное функционирование под воздействием негативных факторов среды. Полученное соотношение нейронов по количеству хроматофильного вещества свидетельствует об адаптации клеток к внешним воздействиям, и переходе их из нормохромного состояния в гипо- или гиперхромное.
Плотность распределения нейронов в исследуемом слое у особей различных биотопов существенно варьирует от минимального значения – 5403,2 (биотоп 3 с низким уровнем загрязнения) до максимальной плотности – 8589,7 (биотоп 1 с высоким уровнем загрязнения). Показатели плотности нейронов находятся в диапазоне значений: 8589,7 > 7943,2 > 7204,3 > 5911,2 > 5403,2.
Таблица 3
Показатели плотности нейронов и глиоцитов VI слоя крыши среднего мозга остромордой лягушки (R. arvalis) на фиксированной площади (1 мм2)
|
Показатель Биотоп |
Плотность нейронов |
Плотность глиисвоб. |
Плотность глиисат. |
Глио-нейрональный индекс, ГНИ |
|
|
ГНИ своб. |
ГНИ сат. |
||||
|
Мe [25%; 75%], абс. число |
|||||
|
1 – р. Березовка, Березовский р-н |
8589,7 [7758,5; 9975,2] |
4433,4 [3602,1; 4987,6] |
2863,2 [2493,8;3325,1] |
0,5 [0,4; 0,6] |
0,3 [0,3; 0,4] |
|
2 – искусственный пруд Канский р-н |
7943,2 [7019,6; 9421,0] |
4064,0 [3325,1; 4710,5] |
2689,6 [2216,7;2955,6] |
0,5 [0,4; 0,6] |
0,3 [0,3; 0,4] |
|
p = 0,005 |
p = 0,084 |
p = 0,0005 |
p = 0,6 |
p = 0,07 |
|
|
3 – пруд ТатанщикАбанский р-н |
5403,2 [4710,5; 6095,9] |
2586,2 [2216,7; 3140,3] |
1662,5 [1385,4; 2216,7] |
0,5 [0,4; 0,6] |
0,3 [0,3; 0,4] |
|
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1 = 0,83 p3,2 = 0,8 |
p3,1 = 0,18 p3,2 = 0,94 |
|
|
4 – пруд ЕгоровкаАбанский р-н |
5911,2 [5541,8; 6650,1] |
3325,1 [2770,9; 4156,3] |
2216,7 1847,3;2493,8] |
0,6 [0,5; 0,7] |
0,4 [0,3; 0,4] |
|
p4,1 = 0,0001 p 4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,002 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,0001 |
|
|
5 – пойма р. Берешь Шарыповский р-н |
7204,3 [6373,0; 7758,5] |
3463,6 [2493,8; 4433,4] |
2432,3 [2216,7; 2798,0] |
0,5 [0,4; 0,6] |
0,3 [0,3; 0,4] |
|
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,0001 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,0003 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,82 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,001 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,36 |
p5,1 = 0,37 p5,2 = 0,62 p5,3 = 0,62 p5,4 = 0,0001 |
p5,1 = 0,48 p5,2 = 0,29 p5,3 = 0,56 p5,4 = 0,0003 |
|
Примечание: значимость различий по сравнению с показателями особей биотопа 1 – 5 (критерий Ньюмана – Кейлса).
При изменении условий среды и воздействии антропогенных факторов наблюдаются комплексные перестройки нервной системы на уровне реактивных структурных, функциональных, метаболических и количественных преобразований нейронов и глиального окружения. Увеличивается пролиферация и миграционная активность глиоцитов, количество перинейрональных сателлитов [1]. В нашей работе наибольшие показатели плотности распределения свободных и сателлитных глиоцитов в VI слое у R. arvalis исследуемых биотопов наблюдаются у животных 1 биотопа из р. Березовка, Березовского района (таблица 3). Минимальные значения плотности глиоцитов у лягушек биотопа 3 из пруда Татанщик Абанского района. Полученные соотношения нейронов, перинейрональной и свободной глии свидетельствуют об увеличении пролиферативной и миграционной активности глии при повышении уровня загрязнения биотопов. Такие динамические перестройки направлены на поддержание стабильности функционирования нервной системы.
Одним из показателей функциональной активности нервных клеток является состояние белкового фонда. В наших исследованиях концентрация и содержание общих водонерастворимых белков в нейронах VI слоя крыши среднего мозга связаны с уровнем загрязнения водоемов. С повышением уровня загрязнения практически во всех слоях в цитоплазме и ядрах нейронов наблюдалось достоверное повышение концентрации и содержания общих водонерастворимых белков. В нейронах VI слоя крыши среднего мозга средние значения концентрации белков в цитоплазме во всех биотопах практически идентичны и превышают значения концентрации белков в ядре. У остромордой лягушки 2, 3, 5 биотопов средние значения концентрации белков в цитоплазме нейронов превышают значения в ядре в 1,7 раз. Меньшие показатели Ся были у особей биотопа 4 (1,3 раза), а наибольшие (2,5 раза) у R. arvalisиз р. Березовка, Березовского района (таблица 4).
Таблица 4
Состояние фонда общих водонерастворимых белков в нейронных популяциях VI слоя крыши среднего мозга остромордой лягушки (R. arvalis)
|
Показатель Биотоп |
Концентрация белков |
Регулятор-ный ЯЦК, рЯЦК |
Содержание белков |
Функциона-льный ЯЦК, фЯЦК |
||
|
в цитоплазме, Сц |
в ядре, Ся |
в цитоплазме, Мц |
в ядре, Мя |
|||
|
Мe [25%; 75%], пкг/мкм2 |
||||||
|
1 – р. Березовка, Березовский р-н |
0,5 [0,4; 0,5] |
0,2 [0,1; 0,2] |
0,4 [0,2; 0,5] |
2,7 [2,4; 3,2] |
1,5 [1,1; 2,2] |
0,6 [0,4; 0,8] |
|
2 – искусственный пруд Канский р-н |
0,5 [0,4; 0,5] |
0,3 [0,2; 0,4] |
0,7 [0,6; 0,8] |
2,8 [2,3; 3,1] |
2,3 [1,9; 3,0] |
0,6 [0,4; 0,9] |
|
p = 0,32 |
p = 0,0001 |
p = 0,0001 |
p = 0,0003 |
p = 0,0001 |
p = 0,0001 |
|
|
3 – пруд ТатанщикАбанский р-н |
0,5 [0,5; 0,5] |
0,3 [0,3; 0,4] |
0,6 [0,5; 0,7] |
3,5 [2,7; 3,9] |
2,9 [2,1; 3,7] |
0,9 [0,7; 1,0] |
|
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,21 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,004 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
p3,1 = 0,0001 p3,2 = 0,0001 |
|
|
4 – пруд ЕгоровкаАбанский р-н |
0,5 [0,5; 0,6] |
0,4 [0,3; 0,4] |
0,7 [0,6; 0,8] |
3,1 [2,7; 3,6] |
3,5 [2,9; 4,5] |
1,1 [1,0; 1,4] |
|
p4,1 = 0,006 p4,2 = 0,0005 p4,3 = 0,16 |
p4,1 = 0,001 p4,2 = 0,0002 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,27 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,0003 p4,3 = 0,21 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,0001 p4,3 = 0,0001 |
p4,1 = 0,0001 p4,2 = 0,004 p4,3 = 0,0001 |
|
|
5 – пойма р. Берешь Шарыповский р-н |
0,5 [0,5; 0,6] |
0,3 [0,3; 0,3] |
0,6 [0,4; 0,7] |
3,0 [2,6; 4,0] |
3,0 [2,6; 3,4] |
0,9 [0,8; 1,2] |
|
p5,1 = 0,002 p5,2 = 0,0002 p5,3 = 0,27 p5,4 = 0,0001 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,002 |
p5,1 = 0,017 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,0001 p5,4 = 0,003 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,44 p5,3 = 0,39 p5,4 = 0,03 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,001 p5,3 = 0,22 p5,4 = 0,05 |
p5,1 = 0,0001 p5,2 = 0,0001 p5,3 = 0,18 p5,4 = 0,6 |
|
Примечание: значимость различий по сравнению с показателями особей биотопа 1 – 5 (критерий Ньюмана – Кейлса).
Значения рЯЦК у особей всех биотопов варьируют в пределах от 0,4 до 0,7, что обусловлено преобладанием концентрации плотных веществ в цитоплазме над таковыми в ядре, при более высоких линейных параметрах последних. Полученные данные также свидетельствуют о снижении интенсивности биосинтеза белка в ядрах клеток и пластического обмена в нейроцитах в целом. Содержание общих водонерастворимых белков в цитоплазме (Мц) превышает содержание белков в ядре (Мя) у животных из 3 и 2 биотопов в 1,2 раза, а у особей биотопа 1 в 1,8 раз. У лягушек 4 и 5 биотопа Мя и Мц имели близкие значения. Высокие показатели содержания белков в цитоплазме и ядрах клеток свидетельствуют о повышенной функциональной активности нейронов VI слоя у R. arvalis 1, 2 и 5 биотопов, и преобладаем процессов биосинтеза белков. Высокие значения фЯЦК (0,6 - 1,2) у особей всех биотопов связаны с превышением содержания белков в цитоплазме нейронов по сравнению с ядром (таблица 4).
Заключение
Для остромордых лягушек из Абанского района (биотопы 3, 4 – с низким уровнем загрязнения) характерно наличие нейронов с типичной организацией, повышение количества гиперхромных клеток (на 25,4 %), находящихся в состоянии покоя и накапливающих тигроид, умеренная плотность распределения нейронов и пролиферативная активность глиоцитов, снижение показателей концентрации (на 20–23 %) и содержания (на 23–50 %) общих водонерастворимых белков. Данные показатели расцениваются как позитивные переадаптации нейроморфологических характеристик нейронов, отражающие обитание амфибий в благоприятных условиях.
Полученные морфоцитохимические данные свидетельствуют о наличии адаптационных перестроек на уровне клеточных популяций нейронов VI слоя крыши среднего мозга амфибий в ответ на негативное воздействие факторов среды. В районах с высоким (Канском и Березовском – биотопы 1, 2) и повышенным (Шарыповском – биотоп 5) уровнем загрязнения у R. arvalis наблюдается увеличение линейных параметров клеток, повышение числа гипохромных нейронов (на 26–32 %), увеличение плотности распределения нейроцитов (на 25–37 %), усиление пролиферативной активности свободных (на 25–42 %) и сателлитных (на 32–42 %) глиоцитов, снижение концентрации и содержания белков в клетках. Данные морфоцитохимические перестройки нейрон-глиальных популяций указывают на наличие в среде обитания у R. arvalis неблагоприятных факторов, ведущих к включению компенсаторных механизмов, находящихся на границе нормы, и нарастанием деструктивных процессов. Пластичность нейроморфологических характеристик нейронов позволяет амфибиям адаптироваться к воздействиям среды и поддерживать жизнеспособность в трансформированных биотопах.