Исследования последнего десятилетия продемонстрировали роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии рака шейки матки (РШМ). Однако высокая инфицированность женщин ВПЧ и сравнительно редкие случаи возникновения РШМ среди инфицированных лиц указывают на то, что ВПЧ не является единственным фактором, необходимым для возникновения рака. В то же время данные литературы свидетельствуют, что в отсутствие ВПЧ-инфекции развитие РШМ ассоциируется с инфицированием хламидиями. Полагают, что связь хламидий со злокачественным ростом может быть обусловлена двумя механизмами: индукцией хронического дефекта антигена и продукцией канцерогенных метаболитов.
Роль Chlamydiatrachomatis (Ch.tr.) как фактора риска развития цервикальной неоплазии широко обсуждается. Однако молекулярные механизмы, с помощью которых Ch. tr. может внести свой вклад в канцерогенез, до конца не установлены. Известно, что Ch. tr. инициирует активацию компонентов онкоген проводящих путей Ras-Raf-MEK-ERK и производство активных форм кислорода для поддержания своего развития [7].
Ранее нами в экспериментальных исследованиях было показано, что инфицирование штаммом Е Chlamydiatrachomatis крыс с перевивной саркомой-45 способствует еще большему усилению интенсивности хемилюминесценции, повышенный уровень которой наблюдался и при опухолевом росте у неинфицированных животных [3].
Одним из методов, позволяющих оценить повреждение ДНК, является гель-электрофорез изолированных клеток – метод ДНК-комет (CometAssay). С использованием этого метода показана в частности роль вируса папилломы человека в вирус-индуцированном мутагенезе, приводящем к клеточной трансформации [9], а также генотоксичность Helicobacterpylori, инфицирование которым увеличивает риск развития рака желудка [1].
Целью данной работы явилась сравнительная оценка уровня поврежденности ДНК, интенсивности перекисного окисления липидов, активности ферментативного звена антиоксидантной системы в клетках крови у больных раком шейки матки с сопутствующей хламидийной инфекцией и у неинфицированных женщин, как больных РШМ, так и без онкопатологии.
Материалы и методы
Уровень окислительного повреждения ДНК в лейкоцитах крови оценивали методом ДНК-комет в щелочной версии. Метод основан на регистрации различной подвижности поврежденной ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, под действием постоянного электрического поля. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого позволяют оценить степень поврежденности исследуемой ДНК. Использовали цельную кровь в соотношении 1:20 с 1% легкоплавкой агарозой, условия электрофореза – 4 ºС, 20 мин., 300мА, 20В. Полученные препараты фиксировали в 70 º этаноле и окрашивали в растворе этидиум бромида (2 мкг/мл). Микроскопирование окрашенных препаратов производили на люминесцентном микроскопе AxioImagerM2, Zeiss при длине волны возбуждения 520 нм, волны эмиссии – 640 нм. В каждой пробе измеряли не менее 200 комет. Уровень повреждения ДНК выражали как процент ДНК хвоста кометы (%ТDNA), который рассчитывали по формуле, учитывающей соотношение пяти визуальных типов комет и их общего количества в пробе [6].
О накоплении молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по уровню наиболее стабильного соединения – малонового диальдегида (МДА), определяемом общепринятым спектрофотометрическим способом. Состояние антиоксидантной системы оценивали по активности ферментов первой линии антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, содержанию восстановленного глутатиона, активности глутатионзависимых ферментов (глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза и глутатионтрансфераза), которые определяли общепринятыми спектрофотометрическими методами [2].
Перечисленные показатели были определены у 19 больных РШМII St., из которых инфицирование Chlamydiatrachomatic было выявлено у 7 пациенток. Инфицированность хламидиями подтверждалась обнаружением IgG иIgA к Ch. tr. или антигена/ДНК Ch. tr. с использованием стандартных методов ИФА и ПЦР. В качестве группы сравнения использованы результаты исследования уровня повреждения ДНК у 13 женщин без онкопатологии (доноры), для остальных показателей группу доноров составили 30 женщин, сопоставимых по возрасту с обследованными больными.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ “Statistica 6.0”. Для оценки значимости различий использовали непараметрический U-критерий Манна – Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Наблюдаемые различия считали статистически значимыми при p<0,05 – p=0,000000.
Результаты исследования и их обсуждение
Как видно из таблицы 1, уровень повреждения ДНК, определенный с помощью метода ДНК-комет, в лейкоцитах крови 19 больных РШМ был значительно выше, чем у женщин без онкологической патологии. При этом у 12 больных РШМ без инфекционного компонента среднее значение T%DNA превышало данный показатель в лейкоцитах здоровых женщин на 53,7 %. Значительно более высокий уровень %TDNA был зафиксирован у всех больных РШМ, инфицированных Ch. tr. У пациенток данной группы среднее значение %TDNA с максимальным уровнем статистической значимости превосходило величину показателя у больных РШМ, неинфицированных хламидиями, в 2,4 раза и было в 3,7 раза выше, чем у здоровых женщин.
Таблица 1
Уровень поврежденности ДНК лейкоцитов крови, содержание малонового диальдегида, активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах крови больных РШМ, неинфицированных и инфицированных Chlamydiatrachomatic
|
Группы |
%ДНК хвоста |
МДА нМ/мл 1% гемолизата |
СОД у.е./мг Hb |
Каталаза мкМH2О2/ мин.×мгHb |
Коэффициент СОД/ каталаза |
|
Доноры (n=30) |
2,83±0,20 (n=13) |
1,495±0,08 |
500,8±16,4 |
135,5±4,12 |
3,75±0,12 |
|
Больные РШМ (n=12) |
4,35±0,43 Р=0,003373 |
1,07±0,048 Р=0,000637 |
366,6±9,26 Р=0,000012 |
129,9±3,91 |
2,842±0,092 Р=0,000048 |
|
Больные РШМ, инфи-цированные Ch.tr. (n=7) |
10,44±0,25 Р=0,000000 Р1=0,000000 |
1,572±0,087 Р1=0,000038 |
481,5±25,2 Р1=0,000086 |
107,0±5,31 Р=0,003093 Р1=0,002737 |
4,539±0,245 Р=0,006857 Р1=0,000001 |
Примечание. Здесь и в таблице 2: р – уровень статистической значимости различий относительно группы доноров, р1 – уровень статистической значимости различий между больными РШМ, инфицированными и неинфицированными хламидиями. Приведены значения р только для статистически значимых различий.
По данным литературы, изменения, наблюдаемые при инфицировании хламидиями, нередко связывают с усилением свободнорадикальных окислительных процессов и снижением антиоксидантного потенциала в организме хозяина. В этой связи мы посчитали необходимым у тех же больных, у которых проведено изучение состояния ДНК, исследовать в клетках крови ряд показателей, характеризующих интенсивность ПОЛ и активность основных ферментативных компонентов антиоксидантной системы.
Согласно полученным данным у обследованных нами больных РШМ, неинфицированных хламидиями, уровень МДА и активность СОД были статистически значимо (р<0,001–0,0001) снижены относительно уровня у женщин без онкопатологии на 28,4 % и 26,8 % соответственно. При этом активность каталазы, фермента, сопряженного с СОД, значимо не изменялась, что привело к нарушению согласованной работы этих ферментов первой линии антиоксидантной защиты. Коэффициент СОД/каталаза был значимо ниже, чем в группе доноров, на 24,2 % (таблица 1).
У больных РШМ, инфицированных хламидиями, интенсивность ПОЛ в эритроцитах была более выражена, чем в группе больных без инфекции, о чем свидетельствовало увеличение содержания МДА на 46,9 %. Это сопровождалось увеличением активности СОД на 31,3 %. Однако происходящее у этих больных снижение активности каталазы (на 17,6 % относительно неинфицированных больных РШМ и на 21 % относительно доноров, р<0,01), привело к противоположно направленным, еще более выраженным нарушениям скоординированной работы системы СОД – каталаза. На это указывает увеличение коэффициента СОД/каталаза на 59,7 % относительно группы неинфицированных Ch. tr. больных РШМ (на 21 % выше среднего значения в группе доноров).
При исследовании показателей, отражающих функционирование глутатионовой системы, у всех обследованных больных РШМ было установлено снижение в эритроцитах активности глутатионредуктазы, участвующей в биорегенерации окисленного глутатиона, при отсутствии статистически значимых изменений содержания восстановленного глутатиона (таблица 2). При этом степень снижения активности глутатионредуктазы у инфицированных хламидиями больных РШМ была значимо ниже, чем у неинфицированных больных: соответственно 17,1 % и 46,6 % относительно активности фермента у здоровых женщин. Только в группе неинфицированных больных наблюдалось снижение активности глутатион-S-трансферазы – на 19,9 % относительно доноров. Основным отличием инфицированных Ch. tr. больных РШМ было увеличение активности глутатиопероксидазы (ГПО) – на 63,1 % относительно группы неинфицированных пациентов и на 46,5 % относительно здоровых женщин. Двукратное снижение величины коэффициентов СОД/ГПО и каталаза/ГПО указывает на возрастание роли ГПО в деградации перекиси водорода у инфицированных хламидиями больных.
Таблица 2
Содержание восстановленного глютатиона и активность глутатионзависимых ферментов в крови больных РШМ
|
Группы |
Глутатион мкМ/мг Hb |
ГПО МЕ/мг Hb |
ГР МЕ/мг Hb |
ГТ МЕ/мг Hb |
СОД/ГПО |
Каталаза/ ГПО |
|
Доноры (n=30) |
31,49±1,1 |
251,2±22,6 |
7,70±0,29 |
62,0±1,81 |
2,502±0,233 |
0,635±0,049 |
|
Больные РШМ (n=12) |
32,59±0,95 |
225,6±13,0 |
4,11±0,15 Р=0,000000 |
49,69±1,47 Р=0,000181 |
1,682±0,102 Р=0,021008 |
0,601±0,044 |
|
Больные РШМ,инфи-цированные Ch.tr. (n=7) |
35,31±3,68 |
368,0±4,7 Р=0,010212 Р1=0,000000 |
6,38±0,43 Р=0,038219 Р1=0,000014 |
64,91±2,26 Р1=0,000017 |
1,305±0,052 Р=0,010376 Р1=0,015458 |
0,291±0,013 Р=0,000766 Р1=0,000067 |
Таким образом, согласно полученным результатам, у больных РШМ имеет место повреждение ДНК клеток крови, впервые показанное нами методом ДНК-комет. Данные литературы также свидетельствуют об увеличении повреждения лейкоцитарной ДНК, оцениваемом по % ДНК хвоста, при ряде других локализаций злокачественного роста [5].
Наличие хламидийной инфекции способствует более чем двукратному увеличению степени повреждения ДНК у онкогинекологических больных. Представленные результаты согласуются с данными, полученными ранее при исследованиях, проведенных на культурах клеток, согласно которым инфицирование хламидиями вызывает модификацию гистонов и двунитевые разрывы ДНК [8].
Высказано предположение, что повреждение ДНК может быть вызвано индуцируемым Ch. tr. снижением антиоксидантного потенциала, приводящим к образованию свободных радикалов [10]. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что ингибирование ключевого антиоксидантного фермента – супероксиддисмутазы характерно для большинства больных РШМ. А наличие хламидийной инфекции у больных РШМ приводит к выраженному дисбалансу в работе ключевых антиоксидантных ферментов. В данной группе больных наблюдается статистически значимое (р<0,01) снижение активности каталазы в эритроцитах крови, что на фоне повышенной относительно значений у больных РШМ, не инфицированных Ch. tr., активности СОД может способствовать интенсификации свободнорадикальных процессов. Об этом, в частности, свидетельствует полуторное повышение у инфицированных больных эритроцитарного уровня МДА – основного молекулярного продукта ПОЛ (таблица 1), а также показанное нами ранее повышение интенсивности перекись-индуцированной хемилюминесценции, отражающее активацию начальных звеньев свободно-радикальных процессов, при экспериментальном канцерогенезе, сочетанном с хламидийной инфекцией [3]. Увеличение активности СОД у инфицированных хламидиями больных РШМ, возможно, является ответной реакцией на усиление ПОЛ. При этом в условиях снижения активности каталазы, приводящего к накоплению перекиси водорода, СОД может взаимодействовать с Н2О2 и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование супероксидного анион-радикала и гидроксильного радикала. Кроме того, высокая активность СОД при сниженной активности каталазы способствует усилению цитотоксического действия Н2О2 [4].
Выявленный в данной работе повышенный уровень СОД у больных РШМ, инфицированных Ch. tr., относительно неинфицированных женщин с РШМ (на 31,3 %, р<0,0001) согласуется с нашими экспериментальными данными, согласно которым у животных с развитием воспалительного процесса хламидийной природы, предшествовавшего опухолевому росту, наблюдалось более выраженное увеличение активности СОД на ранних сроках развития опухолевого процесса [3].
Обращает на себя внимание, что у больных РШМ, инфицированных хламидиями, антиоксидантная система «ГПО-глутатион-глутатиоредуктаза», играющая ключевую роль в защите эритроцитов, находится функционально в более активном состоянии по сравнению с неинфицированными больными, что позволяет предполагать определенные различия в течение злокачественного процесса у инфицированных и неинфицированных хламидиями больных.
Заключение
Анализ результатов позволяет прийти к заключению о том, что выявленное повреждение ДНК при инфицировании Ch. tr. может быть связано с интенсификацией окислительных процессов, обусловленной нарушением согласованности в работе основных антиоксидантных ферментов. Данные, полученные нами при исследовании клеток крови больных РШМ, являются подтверждением роли хламидийной инфекции в повреждении ДНК, способствующем развитию злокачественного поражения органов женской половой системы.