Введение
Наиболее рентабельным и экологически безопасным методом борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур является создание устойчивого исходного материала. Такой селекционный материал с высокой продуктивностью и комплексной устойчивостью к биотическим и абиотическим факторам среды целесообразно получать с привлечением генетического потенциала дикорастущих форм [1; 2]. Эффективному поиску генов устойчивости в настоящее время способствует применение современных технологий молекулярных ДНК-маркеров. В частности, как показано нами ранее на культурном подсолнечнике, они могут успешно использоваться в селекции линий резистентных к ложной мучнистой росе (ЛМР) Plasmopara halstedii [3]. Показавшие высокую информативность в данном случае STS-маркеры - НаР2 и НаР3 идентифицируют локус Pl6, который включает по меньшей мере 11 тесно сцепленных генов, каждый из которых контролирует устойчивость к одной из рас ЛМР [4; 5]. В связи с этим с помощью маркеров НаР2 и НаР3, идентифицирующих линии культурного подсолнечника, резистентные к ложной мучнистой росе, в данной работе был проведен поиск новых доноров генов устойчивости среди образцов однолетних и многолетних видов рода Helianthus L.
Материал и методы
В работе исследовали 22 образца 5-ти однолетних видов (табл. 1) и 91 образец 33-х многолетних видов (табл. 2) подсолнечника из Мировой коллекции ВИР. В анализе использовали праймеры HaP2 и НаР3 [4]. Полимеразную цепную реакцию проводили в стандартной реакционной смеси в термоциклере PalmCycler Corbett Research (Австралия). Для проведенных реакций оптимальным оказался терморежим с начальной денатурацией при 95 °С в течение 3 мин., затем 35 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 60 °С в течение 30 сек., элонгация - 2 мин. при 72 °С, денатурация при 95 °С - 30 сек., финальная элонгация - 1 мин. Продукты реакции амплификации разделяли электрофоретически в 1%-ном агарозном геле с бромистым этидием (1мкг/мл), используя трис-боратный буфер. После электрофореза гели переносили на трансиллюминатор и фотодокументировали с помощью видеосистемы (GelDoc 2000, BioRad, США). В качестве маркеров массы амплифицированных фрагментов использовали набор GeneRuler 1 Kb DNALadder (Fermentas).
Результаты и их обсуждение
В таблице 1 суммированы результаты анализа наличие/отсутствие маркеров локуса Pl6 в генотипе исследованных образцов однолетних видов подсолнечника.
Таблица 1
Образцы однолетних видов подсолнечника из Мировой коллекции ВИР
|
№, п/п |
Вид |
№ интродукции образца |
Наличие гена Pl6 (HaP2/HaP3) |
|
1 |
Helianthus annuus |
441183 |
-/- |
|
2 |
Helianthus annuus |
441236 |
-/- |
|
3 |
Helianthus annuus |
441245 |
-/- |
|
4 |
Helianthus annuus |
545520 |
-/- |
|
5 |
Helianthus annuus |
441169 |
-/- |
|
6 |
Helianthus annuus |
545497 |
-/- |
|
7 |
Helianthus annuus |
504835 |
+/- |
|
8 |
Helianthus annuus |
436863 |
-/- |
|
9 |
Helianthus annuus |
440545 |
-/- |
|
10 |
Helianthus annuus |
545573 |
-/- |
|
11 |
Helianthus annuus |
545577 |
-/- |
|
12 |
Helianthus annuus |
545534 |
-/- |
|
13 |
Helianthus agrophyllus |
Без № ⃰ (4) |
+/- |
|
14 |
Helianthus agrophyllus |
ARG-Mosambic |
+/- |
|
15 |
Helianthus agrophyllus |
1000 |
-/- |
|
16 |
Helianthus agrophyllus |
Мозамбик 1000 |
-/- |
|
17 |
Helianthus debilis |
560388 |
-/- |
|
18 |
Helianthus debilis |
560395 |
-/- |
|
19 |
Helianthus debilis |
545666 |
-/- |
|
20 |
Helianthus petiolaris |
503232 |
-/- |
|
21 |
Helianthus petiolaris |
440660 |
-/- |
|
22 |
Helianthus praecox |
560400 |
-/- |
Примечание: ⃰ - номер делянки
По результатам молекулярно-генетического анализа маркер НаР2, ассоциированный с признаком устойчивости к ЛМР, идентифицирован у образцов Helianthus annuus c номером интродукции 504835 и Helianthus argophillus (Б/№ и ARG-Mosambic) (табл. 1). Данные образцы характеризуются наличием на электрофореграмме ампликона 1200 п.н., специфичного локусу Pl6. С другой стороны, результаты амплификации маркера НаР3 не выявили локусов резистентности в генотипе исследованных однолетних видов. Следовательно, можно заключить, что праймер HaP3 оказался в данном случае не информативным для определения генов устойчивости в представленных генотипах однолетних дикорастущих форм.
В таблице 2 приведены данные ДНК-анализа многолетних видов подсолнечника. Результаты амплификации с праймером НаР2 показали, что маркер локуса устойчивости Pl6 присутствует у 14 из 91 исследованного образца. При этом популяции одного и того же вида с различными номерами интродукции демонстрируют полиморфизм по наличию/отсутствию искомого маркерного фрагмента (табл. 2).
Таблица 2
Образцы многолетних дикорастущих видов подсолнечника из Мировой коллекции ВИР
|
№, п/п |
Вид |
№ интродукции образца |
Наличие локуса Pl6 (HaP2/HaP3) |
|
1 |
Helianthus angustifolius |
1889 |
+/+ |
|
2 |
Helianthus angustifolius |
Б/№ ⃰ (5) |
-/- |
|
3 |
Helianthus angustifolius |
Б/№ ⃰ (3) |
-/- |
|
4 |
Helianthusc californicus |
530447 |
-/- |
|
5 |
Helianthusc californicus |
441063 |
-/+ |
|
6 |
Helianthusc californicus |
Без № ⃰ (52) |
-/- |
|
7 |
Helianthus ciliaris |
Без № ⃰ (51) |
-/- |
|
8 |
Helianthus decapetalus |
440449 |
-/- |
|
9 |
Helianthus decapetalus |
545682 |
-/- |
|
10 |
Helianthus decapetalus |
Без № ⃰ (10) |
-/- |
|
11 |
Helianthus decapetalus |
Б/№ ⃰ (11) |
-/- |
|
12 |
Helianthus decapetalus |
Б/№ ⃰ (13) |
-/- |
|
13 |
Helianthus decapetalus |
Б/№ ⃰ (14) |
-/- |
|
14 |
Helianthus decapetalus parviflorus |
Б/№ ⃰ (15) |
-/- |
|
15 |
Helianthus divaricatus |
2099 |
-/+ |
|
16 |
Helianthus divaricatus |
545674 |
+/+ |
|
17 |
Helianthus divaricatus |
Б/№ ⃰ (17) |
-/- |
|
18 |
Helianthus eggertii |
Б/№ ⃰ (18) |
+/- |
|
19 |
Helianthus eggertii |
Б/№ ⃰ (19) |
-/- |
|
20 |
Helianthus floridanus |
94 |
-/- |
|
21 |
Helianthus floridanus |
Б/№ ⃰ (21) |
-/- |
|
22 |
Helianthus floridanus |
Б/№ ⃰ (6) |
-/- |
|
23 |
Helianthus giganteus |
441029 |
-/- |
|
24 |
Helianthus giganteus |
2100 |
+/+ |
|
25 |
Helianthus giganteus |
Б/№ ⃰ (55) |
-/- |
|
26 |
Helianthus giganteus |
Б/№ ⃰ (56) |
-/- |
|
27 |
Helianthus giganteus |
489253 ⃰ (53) |
-/+ |
|
28 |
Helianthus giganteus |
489253 ⃰ (54) |
-/- |
|
29 |
Helianthus glaucophyllus |
Б/№ ⃰ (95) |
-/- |
|
29 |
Helianthus grosseserratus |
Б/№ ⃰ (64) |
-/- |
|
30 |
Helianthus grosseserratus |
545698 |
-/- |
|
31 |
Helianthus grosseserratus |
Б/№ ⃰ (62) |
+/+ |
|
32 |
Helianthus grosseserratus |
Б/№ ⃰ (61) |
-/- |
|
33 |
Helianthus grosseserratus |
545711 |
-/- |
|
34 |
Helianthus hirsutus |
560389 |
-/- |
|
35 |
Helianthus hirsutus |
441331 |
+/+ |
|
36 |
Helianthus hirsutus |
Б/№ (20) |
-/- |
|
37 |
Helianthus kellemanii |
Б/№ ⃰ (93) |
-/- |
|
38 |
Helianthus laetiflorus |
1886 |
-/- |
|
39 |
Helianthus laetiflorus |
Б/№ ⃰ (41) |
+/+ |
|
40 |
Helianthus laetiflorus |
Б/№ ⃰ (39) |
-/- |
|
41 |
Helianthus laevigatus |
Б/№ |
-/- |
|
42 |
Helianthus macrophyllus (болгарский) |
Б/№ ⃰ (91) |
-/- |
|
43 |
Helianthus macrophyllus (российский) |
Б/№ ⃰ (92) |
-/- |
|
44 |
Helianthu smaximiliani |
2099 |
-/- |
|
45 |
Helianthus maximiliani |
440553 |
+/+ |
|
46 |
Helianthus maximiliani |
Б/№ ⃰ (67) |
-/- |
|
47 |
Helianthus maximiliani(настоящий) |
Б/№ ⃰ (65) |
-/- |
|
48 |
Helianthus maximiliani(поздний) |
96А |
-/- |
|
49 |
Helianthus microcephalus |
Б/№ ⃰ (68) |
-/- |
|
50 |
Helianthus mollis |
50/88 |
-/- |
|
51 |
Helianthus mollis |
2102 |
-/- |
|
52 |
Helianthus mollis (фертильный) |
530453 |
-/- |
|
53 |
Helianthus mollis (стерильный) |
Б/№ ⃰ (69) |
-/- |
|
54 |
Helianthus nuttallii |
442735 |
-/- |
|
55 |
Helianthus nuttallii |
Б/№ ⃰ (70) |
-/- |
|
56 |
Helianthus nuttallii |
Б/№ ⃰ (71) |
-/- |
|
57 |
Helianthus nuttallii |
Б/№ ⃰ (72) |
-/- |
|
58 |
Helianthus occidentalis |
441062 |
+/+ |
|
59 |
Helianthus occidentalis |
Б/№ ⃰ (1) |
-/- |
|
60 |
Helianthus occidentalis |
Б/№ ⃰ (2) |
-/- |
|
61 |
Helianthus occidental sspp. occidentalis |
Б/№ ⃰ (7) |
-/- |
|
62 |
Helianthus occidentalis |
611801 |
+/- |
|
63 |
Helianthus orgyalis |
Б/№ ⃰ (86) |
-/- |
|
64 |
Helianthus parichi |
Б/№ ⃰ (82) |
-/- |
|
65 |
Helianthus parichi |
Б/№ ⃰ (83) |
-/- |
|
66 |
Helianthus rigidus |
545660 |
+/+ |
|
67 |
Helianthus rigidus |
545681 |
-/- |
|
68 |
Helianthus rigidus |
545646 |
-/+ |
|
69 |
Helianthus rigidus |
1886 |
-/+ |
|
70 |
Helianthus rigidus |
2106 |
-/+ |
|
71 |
Helianthus rigidus |
545658 |
-/- |
|
72 |
Helianthus rigidus |
Б/№ ⃰ (37) |
-/- |
|
73 |
Helianthus rigidus |
Б/№ ⃰ (38) |
-/- |
|
74 |
Helianthus salicifolius (болгарский) |
Б/№ ⃰ (36) |
-/- |
|
75 |
Helianthus salicifolius |
440074 |
-/+ |
|
76 |
Helianthus scaberimus |
Б/№ ⃰ (88) |
-/- |
|
77 |
Helianthus simulans |
545659 |
+/+ |
|
78 |
Helianthus simulans |
Б/№ ⃰ (8) |
-/- |
|
79 |
Helianthus smithii |
Б/№ ⃰ (9) |
-/+ |
|
80 |
Helianthus strumosus |
440679 |
+/+ |
|
81 |
Helianthus strumosus |
440683 |
+/+ |
|
82 |
Helianthus sub canescens (болгарский) |
Б/№ ⃰ (90) |
-/- |
|
83 |
Helianthus sub connencens |
Б/№ ⃰ (89) |
-/- |
|
84 |
Helianthus tomentosus |
2107 |
-/- |
|
85 |
Helianthus trachelifolius |
Б/№ ⃰ (81) |
-/- |
|
86 |
Helianthus tuberosus |
441026 |
-/- |
|
87 |
Helianthus tuberosus |
Б/№ ⃰ (48) |
-/- |
|
88 |
Helianthus tuberosus |
2111 |
-/- |
|
89 |
Helianthus tuberosus vilmorin |
Б/№ ⃰ (47) |
-/- |
|
90 |
Helianthus tuberosus subcon |
Б/№ ⃰ (46) |
-/- |
|
91 |
Helianthus umbaburensis |
Б/№ ⃰ (84) |
+/+ |
Примечание: ⃰ - номер делянки
Результаты амплификации маркера НаР3 подтвердили наличие локусов резистентности к ЛМР у образцов H. angustifolius (1889), H. divaricatus (545674), H. giganteus (2100), H. grosseserratus (Б/№ ⃰ (62)), H. hirsutus (441331), H. laetiflorus (Б/№ ⃰ (41)), H. maximiliani (440553), H. occidentalis (441062), H. rigidus (545660), H. simulans (545659), H. strumosus (440679), H. strumosus (440683) и H. umbaburensis (Б/№ ⃰ (84)). В данном случае НаР3 инициировал синтез фрагмента размером около 1800 п.н., характерного для устойчивых линий. Также было показано наличие маркера НаР3 в продуктах амплификации растений H. californicus (№ 441063), H. divaricatus (№ 2099), H. giganteus (№ 489253), H. rigidus (№ 545646, 1886, 2106), H. salicifolius (№ 440074), Helianthus smithii (Б/№ ⃰ (9)) в то время как маркер НаР2 показал отсутствие локусов резистентности к ЛМР у данных форм. У образцов видов H. ciliaris, H. decapetalus, H. floridanus, H. glaucophyllus, H. kellemanii, H. laevigatus, H. macrophyllus, H. smaximiliani, H. mollis, H.microcephalus, H. nuttallii, H. orgyalis, H. parichi, H. scaberimus, H. sub connencens, H. tomentosus, H.trachelifolius, H. tuberosus маркерные фрагменты HaP2/HaP3 локуса Pl6 не обнаружены.
Таким образом можно заключить, что для идентификации локуса устойчивости Pl6 у однолетних видов подсолнечника наиболее информативным является маркер НаР2, а у многолетних видов - НаР3. В то же время необходимо отметить, что в большинстве случаев у многолетних видов результаты амплификации ДНК с праймером НаР2 совпадают с результатами ПЦР-анализа с праймером НаР3. По результатам молекулярно-генетического анализа с данными праймерами были выделены новые доноры генов устойчивости среди однолетних и многолетних видов рода Helianthus L. Выделенные образцы из коллекции ВИР представляют непосредственный интерес для селекции культурного подсолнечника.
Исследование выполнено в рамках темы Министерства образования и науки РФ (№ 4.5642.2011) и при финансовой поддержке ФЦП Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.740.11.0485).
Рецензенты:
Чистяков В.А., д.б.н., заведующий лабораторией экспериментального мутагенеза НИИ биологии ЮФУ, г. Ростов-на-Дону.
Костылев П.И., д.с.-х.н., профессор, заведующий лабораторией риса ГНУ «ВНИИЗК им. И.Г. Калиненко» РАСХН, г. Зерноград.