Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

АЛГОРИТМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТECT-CИСТЕМЫ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ B. BRONCHISEPTICA

Васильева Ю.Б. 1 Мастиленко А.В. 1 Васильев Д.А. 1 Бадаев Р.Р. 2 Мерчина С.В. 1 Швиденко И.Г. 3 Суркова Е.И. 1
1 ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина»
2 Московский финансово-юридический университет
3 ФГБОУ ВПО «Саратовский аграрный университет им. Н.И. Вавилова»
В работе приводятся результаты изучения алгоритмов применения тeст-cистемы индикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica (ТСИИ ББР). ТСИИ ББР включает бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты, обеспечивает раннюю и точную диагностику бордетеллёза. Бактериологический компонент системы эффективен и обладает достаточно высокой специфичностью, но его проведение трудоемко, длительно (72-96 ч) и является дорогостоящим. Иммунологический компонент экспрессный, но недостаточно специфичный и не может быть использован как самостоятельный. Молекулярно-генетический компонент идентификации, являясь быстрым, высокочувствительным и специфичным, не позволяет определить жизнеспособность микроорганизмов и дифференцировать текущую инфекцию от прошедшей. Фаговый компонент экономичнее бактериологического, так как на его проведение затрачивается меньшее количество лабораторной посуды, сред и реактивов.
бактерии вида B.bronchiseptica
тест-система
индикация
идентификация
1. Васильев, Д.А. Применение полимеразной цепной реакции при идентификации возбудителя бордетеллеза животных / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Васильева // Естественные и технические науки. – 2010. - № 5. – С. 230-232.
2. Васильев, Д.А. Выделение и идентификация Bordetella bronchiseptica от животных / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Ю.Б. Васильева // Естественные и технические науки. – 2010. - № 5. – С. 233-235.
3. Васильев, Д.А. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина, С.Н. Золотухин, Ю.Б. Васильева [и др.] // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2011. - №1 (13). – - С. 59–62.
4. Васильева, Ю.Б. Конструирование биопрепаратов для лабораторной диагностики бордетеллёзной инфекции / Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2013. - №2 (22). – С. 25-29.
5. Васильева, Ю.Б. Разработка методов фагодиагностики бордетеллёза / Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2013. - №2 (22). – С. 51-56.
6. Васильева, Ю.Б. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики бордетеллёза / Ю.Б. Васильева // Современные проблемы науки и образования. – 2013. - № 4. – С. 275. – URL: http://www.science-education.ru/110-9751.
7. Васильева, Ю.Б. Особенности биологии бактерий вида Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Современные проблемы науки и образования. – 2013. - № 4. – С. 285. – URL: http://www.science-education.ru/110-9927.
8. Васильева, Ю.Б. Эффективность иммунохимических методов для анализа антигенного состава Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Фундаментальные исследования. – 2013. - № 10. – Ч.1. – С. 100-104.
9. Васильева, Ю.Б. Новая тест-система идентификации возбудителя бордетеллёза – Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Фундаментальные исследования. – 2013. - № 10. – Ч.2. – С. 334-338.
10. Васильева, Ю.Б. Разработка методов детекции бактерий Bordetella bronchiseptica // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2013. - №3 (23). – С. 46-51.
11. Васильева, Ю.Б. Фаги бактерий Bordetella bronchiseptica: свойства и возможности применения / Васильева Ю.Б. / Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2013. - № 4 (24). – С. 44-49.
12. Васильев, Д.А. Разработка методов выделения и селекции бактериофагов Bordetella bronchiseptica / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина // Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». – Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. – Т.I. – С. 28-32.
13. Васильева, Ю.Б. Биотехнологический подход в разработке метода идентификации Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин // Материалы V-й Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения». – Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. – Т.II. – С. 15-18.
14. Васильев, Д.А. Технология конструирования диагностического биопрепарата на основе бактериофагов Bordetella bronchiseptica и перспективы его применения / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина // Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». – Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. – Т.II. – С. 99-104.
15. Васильев, Д.А. Индикация Bordetella bronchiseptica из объектов внешней среды и клинических образцов / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина, Е.Г. Семанин // Материалы V-й Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути решения». – Ульяновск: ГСХА им. П.А. Столыпина, 2013. – Т.II. – С. 18-22.
16. Васильева, Ю.Б. Основы подбора компонентов питательных сред для первичного выделения Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г Сверкалова, А.Г. Семанин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2014. - № 1 (25). – С. 85-92.
17. Мастиленко, А.В. Разработка системы дифференциации B.bronchiseptica и B.pertussis на основе мультиплексной ПЦР в режиме «Реального времени» / А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, О.Ю. Борисова, Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2014. - № 1 (25). – С. 50-54.
18. Нафеев, А.А. Вопросы эпидемиолого-эпизоотологического надзора за зоонозными инфекциями / А.А. Нафеев, Н.И. Пелевина, Ю.Б. Васильева // Дезинфекционное дело. – 2014. - № 1. – С. 39-43.
19. Никульшина, Ю.Б. Разработка методов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, выделенных от домашних животных / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Е.Н. Никулина // Ветеринарная патология. – 2007. - №4. (23). – С. 103-106.
20. Никульшина, Ю.Б. Культивирование Bordetella bronchiseptica на различных селективных средах / Ю.Б. Никульшина, Д.Г. Сверкалова, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Н. Хлынов // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». – Ульяновск: УГСХА. – Т. IV. – 2008. – С. 57-59.
21. Сверкалова, Д.Г. Создание транспортной и накопительной сред для Bordetella bronchiseptica // Д.Г. Сверкалова, А.В. Мастиленко, Д.Н. Хлынов, Ю.Б. Никульшина, Д.А. Васильев / Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования». – Ульяновск: УГСХА, 2008. – Т. IV. – С. 134-136.
22. Vasilyeva, Yu.B. Selection of the complex of microbiological tests for Bordetella bronchiseptica typing / Yu.B. Vasylyeva // Вестник Орловского государственного аграрного университета. – 2013. – Т. 43. - № 4. – С. 44-46.
23. Vasilyeva, Yu.B. Identification of Bordetella bronchiseptica bacteria with the help of polymerase chain reaction in monoand multyplex format / Yu.B. Vasylyeva / Вестник Орловского государственного аграрного университета. – 2013. – - Т. 45. - № 6. – С. 81-85.

Диагностика бордетеллеза имеет большое значение, так как бордетеллёз – инфекционное заболевание, передающееся от домашних животных – собак, кошек – человеку [1, 2, 3, 4].

Животные-носители могут быть источниками распространения заболевания других животных и взрослых людей, со слабым иммунным статусом, имеющих в анамнезе хронические системные заболевания, перенесших травмы, операции. Особенно восприимчивы дети [7, 11].

Диагноз на бордетеллезную инфекцию собак устанавливают на основании комплексных клинико-эпизоотологических данных, результатов патологоанатомических, бактериологических и серологических исследований. В сложных случаях ставят биологическую пробу на щенках.

Слизь, отобранную из носовой полости или глотки центрифугируют при 2500 – 3000 об/мин в течение 15 минут, а из надосадочной жидкости делают высевы на питательные среды. Тампонами, смоченными в носовой слизи, проводят несколько раз по поверхности твёрдой питательной среды (лёгкое круговое втирание). В положительном случае уже через 24-48 часов инкубации высевов, при температуре +37°С, на агаре появляются мелкие колонии, размером 2-3 мм серовато-белого цвета. Зоны гемолиза образуются на средах с кровью. На среде Гартоха через 48 часов вырастают беловатые, каплевидные колонии, а на агаре Мак-Конки – розовые со светлым центром [1-23].

Ускоренная дифференциация культур бордетелл проводится с помощью реакции агглютинации на предметном стекле с положительными и отрицательными сыворотками; определение их биохимических особенностей на пёстром ряду и уреазной активности (положительная) с учётом микроскопических и культуральных результатов исследований [1, 5].

Материалы и методы. Нами разработана тeст-cистема индикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica.

Бактериологическая детекция нацелена на выделение чистой культуры бактерий B.bronchiseptica.

Проводится взятие глубоких мазков из глотки животных на 2 чашки Петри с дифференциально-диагностической средой с селективной добавкой и без неё и культивирование в течение 24-48 ч в термостате при температуре 36+1°С.

На 2-3-е сутки исследования (48-72 ч): отбор и изучение не менее 3-х характерных колоний бирюзового цвета, возможно с темно-синим центром. Колонии других микроорганизмов могут изменять цвет среды с зеленого на жёлтоватый. Колонии B.bronchiseptica могут быть полиморфны. Подозрительными являются россинчатые, выпуклые, влажные, гладкие, блестящие с ровными краями, маслянистой консистенции, легко снимающиеся с поверхности среды колонии диаметром от 1 до 2 мм (фаза I) и более крупные (до 3-4 мм), плоские с приподнятым центром и шероховатыми краями колонии (фаза III) или переходные формы (фаза II). При наличии значительного количества однотипных подозрительных колоний проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков с обнаружением мелких грамотрицательных коккобацил, равномерно располагающиеся в мазке одиночно, по парам или короткими цепочками. Проводят отсев подозрительных колоний на скошенный МПА для выделения чистой культуры и наращивания бактериальной массы в течение 24 ч. При отсутствии роста подозрительных колоний чашки Петри вновь помещают в термостат на 24-48 ч и просматривают повторно.

На 3-4-е сутки исследования (72-96 ч) просматривают посевы для выделения чистой культуры, проводят микроскопию и биохимические тесты. Учитывают хороший рост B.bronchiseptica на МПА в течение 24-48 ч, аэробность, наличие оксидазной, каталазной и гемолитической активности. Если в течение 4-х суток на среде выращивания не обнаружены подозрительные колонии дают окончательный отрицательный ответ.

Иммунологическая детекция применяется для обнаружения в исследуемом материале с помощью гипериммунной сыворотки специфических антигенов B.bronchiseptica (дополнительный компонент бактериологического исследования).

При помощи иммунопрепаратов проводят пластинчатую реакцию агглютинации на предметном стекле или реакцию диффузной прецепитации.

Молекулярно-генетическая детекция нацелена на обнаружение ДНК бактерий B.bronchiseptica в биоматериале без выделения чистой культуры или как подтверждение бактериологического исследования.

Проводят выделение нуклеиновых кислот из культур сорбентным способом, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с разработанными системами праймеров (Pr1-1 (5’ ccttccagcacctggcggtacgagttgctcc 3’), Pr1-2 (5’ ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3’) для гена BfrA ДНК B.bronchiseptica; Pr3-1 (5’ggacgaccaggatcacatcttcc 3’), Pr3-2 (5’ gctttcctggtagttgg-cgtagg 3’) для гена BfrZ; Pr4-1 (5’ gcattgctccatcctgttgtgcg 3’), Pr4-2 (5’ gatgggttatctgagcgcgc 3’) для гена Cytochrom–C–oxidase и Pr5-1 (5’ ctacgggggaaagcggggga 3’), Pr5-1 (5’ gaccgtactccccaggcggt 3’) для гена 16S rRNA), флуоресцентный зонд для системы праймеров участка гена bfrZ), детекция с помощью горизонтального электрофореза и в режиме «реального времени». Программа проведения ПЦР с электрофоретической детекцией − 1) 95°С−5 мин, 2) 95°С−10 сек, 62°С−10 сек, 72°С−20 сек − 40 циклов, 3) 72°С−2 мин; для детекции в режиме реального времени − 1) 95°С−5 мин, 2) 95°С−10 сек, 62°С−15 сек − 40 циклов, 3) 72°С−1 мин.

Детекция специфическими фагами позволяет обнаружить бактерии B.bronchiseptica реакцией нарастания титра фага (РНФ) без выделения чистой культуры (самостоятельный метод) или подтверждение бактериологического исследования методом «стекающей капли» (дополнительный метод к бактериологической схеме). Для постановки реакции нарастания титра фага (РНФ) каждую исследуемую пробу вносят в стерильную колбу с МПБ в соотношении 1:10. Содержимое колбы встряхивают с последующим отстаиванием взвеси в течение 10 минут. Готовят 3 широкие пробирки (диаметр 20 мм), их нумеруют №1, №2, №3. В пробирки №1, №2 вносят по 9 мл исследуемой взвеси, в пробирку №3 - 9 мл стерильного МПБ. В пробирки №1 и №3 добавляют 1 мл биопрепарата «ББР-117 УГСХА», в пробирку №2 вносят 1 мл МПБ. Пробирка №1 является опытной. Пробирка №2 – является контролем для выявления в пробах свободного фага. Пробирка №3 – контроль на титр индикаторного фага. Все три пробирки выдерживают в течение 7 часов при температуре 37ºС. Затем содержимое каждой пробирки разводят питательным бульоном (рН 7,4-7,6) так, чтобы при высеве 1 мл содержимого из пробирки №3 (контроль на титр фага) на чашках Петри образовалось несколько десятков негативных колоний (зон лизиса) фага. В пробирке №3 индикаторный фаг находился в концентрации нескольких тысяч корпускул в 1 мл, и для того, чтобы получить в конечном разведении несколько десятков корпускул в 1 мл, содержимое пробирки №3 разводили в 20 раз, т.е. 0,25 мл исследуемой смеси вносят в 4,5 мл бульона. Содержимое опытных пробирок №1 и №2, разводят аналогично. Инактивацию микрофлоры разведенных смесей проводят путем обработки хлороформом в соотношении к фаголизату 1:10 в течение 15 минут. Содержимое пробирок исследуют на определение числа корпускул бактериофага методом агаровых слоев. Результат реакции учитывают методом подсчета негативных колоний фага в опытных и контрольных чашках Петри. Положительная реакция характеризуется увеличением количества корпускул по сравнению с контролем в 5 и более раз.

Для постановки реакции «стекающей капли» на поверхность дифференциально-диагностической среды пипеткой наносят 3-4 капли бульонной 18 ч культуры исследуемых микроорганизмов, распределяют её по поверхности среды, подсушивают, делят чашку на два сектора и наносят на один сектор фаговый биопрепарат, на другой – стерильный МПБ. Наличие зоны лизиса на сплошном газоне исследуемой культуры сектора с биопрепаратом указывает на принадлежность штамма к бактериям B.bronchiseptica.

Алгоритм использования ТСИИ ББР представлен на рисунке 1. Все компоненты имеют сильные и слабые стороны, что надо учитывать исходя из целей и масштабов исследований.

Так, бактериологический компонент системы эффективен и обладает достаточно высокой специфичностью, но его проведение трудоемко, длительно (72-96 ч) и является дорогостоящим.

Иммунологический компонент экспрессный, но недостаточно специфичный и не может быть использован как самостоятельный.

Молекулярно-генетический компонент идентификации, являясь быстрым, высокочувствительным и специфичным, не позволяет определить жизнеспособность микроорганизмов и дифференцировать текущую инфекцию от прошедшей.

Мультиплексная ПЦР дает возможность выделить возбудителя среди близкородственных бактерий. Негативными моментами являются высокая стоимость анализов, многоэтапность и возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, как следствие контаминации лабораторий ДНК материалом и ошибок операторов.

Фаговый компонент экономичнее бактериологического, так как на его проведение затрачивается меньшее количество лабораторной посуды, сред и реактивов. Методика фагодиагностики бордетеллёза является простой, высоко специфичной и занимает 26 ч при постановке реакции нарастания титра фага и 60 ч – СПОТ-теста.

РНФ может использоваться как самостоятельный компонент тест-системы, СПОТ-тест в качестве дополнения бактериологической схемы.

Рекомендуем для эффективного выбора отдельных диагностических компонентов или их сочетанного использования учитывать: масштабы планируемых исследований (массовые или индивидуальные обследования), контингент животных (уличные, домашние, вид, возраст, иммунный статус и др.), период инфекционного цикла (инкубация, простудные симптомы, «лающий кашель», выздоровление) и возможности лаборатории.

Тест-систему рекомендуем использовать для подтверждения клинического диагноза, выявления атипичных форм заболевания, обнаружения бактерионосителей.

Рис. 1. Компоненты ТИСС ББР. Ф – фаговый, И – иммунологический, Б – бактериологический, М – молекулярно-генетический

Рецензенты:

Золотухин С.Н., д.б.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина», г. Ульяновск;

Нафеев А.А., д.м.н., заведующий отделением особо опасных инфекций, природно-очаговых инфекций и профилактики туберкулеза ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ульяновской области», г. Ульяновск.


Библиографическая ссылка

Васильева Ю.Б., Мастиленко А.В., Васильев Д.А., Бадаев Р.Р., Мерчина С.В., Швиденко И.Г., Суркова Е.И. АЛГОРИТМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТECT-CИСТЕМЫ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ B. BRONCHISEPTICA // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 5.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=14900 (дата обращения: 15.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252