В динамике иммунологической реактивности при термической травме (ТТ) выделяют как минимум три фазы: период ранней иммунодепрессии, захватывающий первые дни после ожога; период компенсации, характеризующийся усилением иммунореактивности; период поздней иммунодепрессии, возникающий только после обширных повреждений. Сведения об изменении иммунного статуса в ранние сроки ТТ противоречивы, большинство исследователей отмечают активацию фагоцитов, изменение активности комплемента, концентрации в сыворотке иммуноглобулинов и др. опсонинов, депрессию клеточного звена адаптивного иммунитета, неоднозначны сведения о цитокиновом профиле. В то же время дисфункция иммунной системы при ТТ является причиной повышенной восприимчивости к условно-патогенной микрофлоре, гнойно-септических осложнений, септического шока, расширения зоны вторичной альтерации, полиорганной недостаточности и летальности, поэтому терапевтические подходы в комбустиологии в первые сутки ведения пациентов должны включать иммунокорригирующие подходы. В этом отношении перспективным фармакологическим агентом может выступить эритропоэтин (ЭПО). Ранее нами продемонстрировано протекторное влияние эритропоэтина (ЭПО) на иммунный статус при хронической почечной недостаточности, а также на врожденный иммунитет при ТТ [1-7]. Интерес к ЭПО обусловлен его плейотропными эффектами, включающими, кроме иммунотропного, кардиотропный, нефроцитопротекторный, антиоксидантный, стимулирующий репарацию тканей.
Цель работы - исследовать механизм влияния экзогенного ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при экспериментальной ТТ.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 54 белых нелинейных крысах массой 180-220 г, находящихся в стандартных условиях вивария на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., при свободном доступе к пище и воде при 12-14-часовом световом дне. Все манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным, методическими рекомендациями по их выведению из опыта и эвтаназии. Экспериментальные животные разделены на 3 группы: группа 1 - интактные животные (n=18), группа 2 - животные с термической травмой (n=18), группа 3 - животные с термической травмой, которым вводили ЭПО (n=18). Для создания модели ТТ использовали плоскодонный стеклянный стакан из химического стекла с диаметром дна 4 см, наполненный дистиллированной водой с температурой 100 °С, время контакта с кожей для моделирования ТТ ІІІА степени составило 30 с. Площадь ожога вычисляли по формуле площади круга, в нашем эксперименте она составила 12,56 см². Для расчета поверхности тела у крыс использовали формулу Мее-Рубнера в модификации Lee: S=К•W0,6, где S - поверхность тела в квадратных сантиметрах, К - коэффициент, равный 12,54, W - вес животного в граммах. Площадь поверхности тела животных в нашем эксперименте составила 336,44±12,67 см². Так как абсолютная площадь ожога была одинаковой во всех случаях (12,56 см²), то относительная площадь ожога составила 3,97±0,14%, т.е. около 4%. ЭПО в составе препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, Roche, Швейцария) вводился внутрибрюшинно, начиная с 1-х суток, ежедневно в дозе 500 МЕ/кг массы в течение 3 дней, суммарная доза 1500 МЕ/кг. Контрольной группе животных с ТТ вводилось эквиобъемное количество стерильного физиологического раствора. Исследования проводили на 3-и сутки. Забор крови проводили под общим ингаляционным наркозом (диэтиловый эфир) путем пункции левого желудочка сердца в вакуумные пробирки фирмы «Вакуэт» (Австрия).
Количество популяций лимфоцитов в периферической крови у крыс определяли методом прямой иммунофлуоресценции цельной крови с использованием моноклональных антител CD3 (клон 1F4) - экспрессируется на Т-лимфоцитах, CD45RA (клон OX-33) - экспрессируется преимущественно на В-лимфоцитах. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США), результат выражали в 109/л крови. Оценку гуморального иммунного ответа крыс проводили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в селезенке крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, результат выражали в абсолютном количестве и в пересчете на 106 ядросодержащих клеток в селезенке. Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у крыс, иммунизированных аллогенными эритроцитами, оценивали по выраженности воспалительного отека стопы волюмометрическим методом. Лимфоциты из периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности фиколла и урографина («ДНК-технология», Россия), концентрацию лимфоцитов в суспензии доводили до 3•106/л. Гибель лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США), результат выражали в % клеток. Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v.10.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Вальда-Вольфовитца, наличие связи между показателями исследовали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Отличия считали значимыми при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. При экспериментальной ТТ в периферической крови количество Т-лимфоцитов (CD3+) снижается на 28%, количество В-лимфоцитов (CD45+) снижается на 27% средних значений в контрольной группе (таблица 1).
Таблица 1
Влияние эритропоэтина на показатели адаптивного иммунитета при термической травме (M±m)
|
Показатели |
1 группа Интактные |
2 группа ТТ |
3 группа ТТ+ЭПО |
|
CD3+, •109/л |
3,14±0,12 |
2,25±0,16 p1-2<0,01 |
4,55±0,22 p1-3<0,01 p2-3<0,01 |
|
CD45+, •109/л |
2,22±0,14 |
1,60±0 p1-2<0,01 |
2,55±0,07 p2-3<0,01 |
|
Интенсивность реакции ГЗТ, мл |
0,36±0,03 |
0,28±0,04 p1-2<0,01 |
0,68±0,01 p1-3<0,01 p2-3<0,01 |
|
АОК в селезенке, • 104 ед. |
192,19±24,69 |
22,31±3,07 p1-2<0,01 |
24,77±2,21 p1-3<0,01 |
|
АОК в селезенке, • 106 ЯСК |
125,33±33,50 |
30,75±2,91 p1-2<0,01 |
64,54±14,37 p1-2<0,01 p2-3<0,01 |
Развитие лимфоцитопении сопровождается депрессией Th1-зависимого иммунного ответа, что проявляется снижением интенсивности реакции ГЗТ на 22% от средних значений в контрольной группе. Депрессия Th2-зависимого иммунного ответа презентируется снижением количества антителообразующих клеток в селезенке в абсолютных величинах в 8,7 раза от средних значений в контрольной группе, в пересчете на 106 ядросодержащих клеток в селезенке количество антителообразующих клеток снижается в 4,2 раза.
Одним из механизмов развития лимфоцитопении и депрессии Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа может выступать активация гибели иммунокомпетентных клеток. Результаты исследования гибели лимфоцитов периферической крови путем некроза и апоптоза представлены в табл. 2.
Таблица 2
Влияние эритропоэтина на показатели гибели лимфоцитов периферической крови при термической травме (M±m)
|
Показатели |
1 группа Интактные |
2 группа ТТ |
3 группа ТТ+ЭПО |
|
Интактные клетки (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), % клеток |
98,09±1,35 |
96,70±0,22 p1-2<0,01 |
97,75±0,20 p2-3<0,01 |
|
Ранний апоптоз (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), % клеток |
1,62±0,09 |
2,90±0,27 p1-2<0,01 |
2,00±0,22 p2-3<0,01 |
|
Поздний апоптоз/некроз (Annexin-5-FITC+/7-AAD+), % клеток |
0,10±0,03 |
0,15±0,02
|
0,10±0
|
|
Некроз (Annexin-5-FITC - / 7-AAD +), % клеток |
0,19±0,03 |
0,25±0,07 p1-2<0,01 |
0,21±0,02
|
Установлено снижение представительства интактных клеток (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), увеличение количества клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-), признаками некроза (Annexin-5-FITC - / 7-AAD +). С использованием корреляционного анализа установлено наличие обратной средней силы связи между количеством лимфоцитов в крови с ранними признаками апоптоза и количеством Т-лимфоцитов (коэффициент корреляции Спирмена R= - 0,45; р<0,05), В-лимфоцитов (R= - 0,41; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,57; р<0,05), количеством АОК в селезенке в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (R= - 0,51; р<0,05). Кроме того, зафиксирована обратная слабая связь между количеством лимфоцитов в крови с признаками некроза и количеством Т-лимфоцитов (R= - 0,39; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,35; р<0,05).
Применение ЭПО при экспериментальной ТТ приводит к увеличению количества
Т-лимфоцитов (CD3+) и
В-лимфоцитов (CD45+) в
периферической крови, причем количество Т-лимфоцитов становится выше, чем в
группе интактных животных. Интенсивность реакции ГЗТ, отражающая выраженность Th1-зависимого иммунного
ответа, в условиях применения ЭПО повышается и становится статистически значимо
выше, чем в группе интактных животных. ЭПО повышает количество АОК в селезенке
в пересчете на
106 ядросодержащих клеток, однако их количество не достигает
значений в группе интактных животных.
Одним из механизмов влияния ЭПО на показатели адаптивного иммунитета при ТТ выступает ограничение апоптоза лимфоцитов. В условиях применения ЭПО повышается количество интактных лимфоцитов (Annexin-5-FITC-/7-AAD-), снижается количество клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-). По данным корреляционного анализа, наблюдается отрицательная средней силы связь между количеством клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD-) и количеством Т-лимфоцитов (R= - 0,52; р<0,05), интенсивностью реакции ГЗТ (R= - 0,59; р<0,05) и отрицательная слабая связь с количеством В-лимфоцитов (R= - 0,33; р<0,05), количеством АОК в селезенке в пересчете на 106 ядросодержащих клеток (R= - 0,38; р<0,05).
По данным других исследователей, уже в раннем периоде после ТТ происходят выраженные дистрофические изменения в тимусе, вызывающие глубокую депрессию Т-клеточного звена иммунитета, которая проявляется как в снижении общего количества Т-лимфоцитов, так и различных субпопуляций с изменением их функциональной активности. Степень снижения числа Т-лимфоцитов находится в определенной зависимости от тяжести ТТ [9; 10]. Определенную роль в подавлении активности Т-лимфоцитов при ТТ, в частности ответ CD4+ наивных клеток на антигенную стимуляцию и формирование клона антиген-специфических Т-лимфоцитов, играют Т-регуляторные лимфоциты (Tregs). В Т-лимфоцитах при ТТ нарушены механизмы внутриклеточной сигнализации, опосредованные митоген-активируемыми протеинкиназами и Са2+ [8]. Протеинкиназа С опосредует цАМФ-зависимые эффекты простагландина Е2 в подавлении активности Т-лимфоцитов после ТТ. Механизм нарушения функции Т-лимфоцитов окончательно не определен, о чем свидетельствуют многочисленные сведения, зачастую противоречивого характера. Одним из механизмов подавления функциональной активности Т-лимфоцитов при ожогах выступает повышение концентрации в плазме протеина HMGB1 (high mobility group box-1), обратно коррелирующее с отношением CD4/CD8. Кроме повышенной гибели лимфоцитов по механизму апоптоза в качестве альтернативной причины Т-клеточной дисфункции рассматривается и другой механизм: активная супрессия вследствие раннего смещения цитокинового баланса в сторону противовоспалительных медиаторов. Причем выраженность апоптоза лимфоцитов, как было установлено в TUNEL-тесте у крыс при ТТ, зависит от уровня эндотоксинемии. Получены сведения о значимой корреляции полиморфизма гена CD14+ и Т-клеточного иммунитета, что, в частности, предрасполагает к развитию септических осложнений у ожоговых пациентов.
Наряду с изменениями клеточного иммунитета при ТТ происходит снижение количества В-лимфоцитов. Однако В-система характеризуется большей устойчивостью, изменение гуморального иммунного ответа характеризуется сдвигами в концентрации иммуноглобулинов. Большинство исследователей наблюдали уже на 1-3 сутки после ТТ снижение уровня Ig М, Ig А, а в случае глубоких ожогов увеличение содержания Ig G. Направленность и величина отклонений в уровне иммуноглобулинов зависит не только от активности антителообразующих клеток, но и от их количества, которое уменьшается в результате плазмореи, распада их вследствие повышения активности протеолитических ферментов.
Выводы
1. При экспериментальной термической травме в периферической крови снижается количество Т- и В-лимфоцитов, угнетается Th1- и Th2-зависимый иммунный ответ, увеличивается количество лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.
2. Снижение количества Т- и В-лимфоцитов в крови, угнетение Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа прогрессирует по мере увеличения количества лимфоцитов с признаками апоптоза и некроза.
3. Применение эритропоэтина в суммарной дозе 1500 МЕ/кг приводит к частичному или полному восстановлению количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа, снижению количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.
4. Восстановление количества Т- и В-лимфоцитов в крови, Th1- и Th2-зависимого иммунного ответа при экспериментальной термической травме в условиях применения эритропоэтина ассоциировано со снижением количества лимфоцитов в крови с признаками апоптоза и некроза.
Рецензенты:Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.
Библиографическая ссылка
Осиков М.В., Кишкин А.М., Федосов А.А. МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 3. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=20146 (дата обращения: 19.04.2024).