Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Франциянц Е.М. 1 Козлова Л.С. 1 Мезенцев С.С. 1 Газиев У.М. 1

---

1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России

Изучена динамика общей активности трипсиновых протеиназ, общего калликреина и универсальных ингибиторов плазмы крови в период подготовки больных раком головки поджелудочной железы (РГПЖ, Т2-4N0M0) к панкреатодуоденальной резекции (ПДР). После каждого из двух этапов подготовительных процедур рост ингибиторной емкости крови наблюдался только в 1-е сутки при сохранении и активации протеолиза. Значимое снижение активности протеиназ в плазме крови формировалось к концу второй недели после аппаратного плазмафереза (АПФ). Непосредственно перед ПДР, на 30-е сутки после АПФ, протеиназо-ингибиторный дисбаланс восстанавливался. Осложнения после ПДР могут быть связаны с наблюдаемым дисбалансом в отношениях «фермент—фермент» и «фермент—ингибитор» системы трипсиноподобных протеиназ. Учитывая приведенные результаты, при составлении плана подготовительных процедур и сроков ПДР следует ориентироваться на срок не позднее 10–14-го дня после АПФ.

Статья в формате PDF

163 KB

подготовка к оперативному лечению рака поджелудочной железы

острофазовые белки плазмы крови

1. Акбашева О.Е., Бурковская В.А., Деханд А.Е. и др. Активность трипсиноподобных протеиназ и деградация коллагена слизистой оболочки кишечника при заболеваниях желудочно-кишечного тракта. РЖГГК. 2010; 20: 31-38.

2. Висмонт Ф.И., Шуст О.Г., Шуст Л.Г. Роль альфа-1-антитрипсина крови в регуляции детоксикационной функции печени и температуры тела при эндотоксиновой лихорадке. Белорус. мед. журн. 2004; (2): 31-33.

3. Гемостаз. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/clinlab/classes_stud/ru_htm (Опубликовано 29 июня 2011 г.).

4. Зорина В.Н., Козлов И.Г., Третьякова Т.В. и соавт. Некоторые реактанты острой фазы при различных типах пролиферативных заболеваний придатков матки. Клиническая лабораторная диагностика. 2009; (10): 16-19.

5. Кондранина Т.Г., Горин В.С., Григорьев Е.В., Степанов В.В., Молоткова Е.Д. Белки острой фазы воспаления и маркеры эндотоксинемии, их прогностическая значимость в гинекологической практике. Российский вестник акушера-гинеколога. 2009; (3): 26-30.

6. Оглоблина О.Г., Арефьева Т.И. Роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в инвазии злокачественных опухолей (обзор литературы). Биохимия. 1994; 59: 340-352.

7. Третьякевич З.Н., Левчин А.М., Анцупова В.В., Федота А. М. Калликреин-кининовая система как адаптационно-защитное звено организма. Изд. «Современная медицина: актуальные вопросы»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (Публикация 26 августа 2013 г.).

8. Франциянц Е.М., Козлова Л.С., Мезенцев С.С., Газиев У.М. Метаболическое обоснование целесообразности чрескожной чреспеченочной холангиостомии при раке панкреогепатодуоденальной зоны. Фундаментальные исследования. 2015; (1): 1457-1461.

9. Эндотоксикоз. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://bagazhznaniy.ru/medicina/endotoksikoz-2(дата публикации 8.05.12).

10. Яровая Г.А. Калликреин-кининовая система. Прошлое и настоящее.URL: http://www.myshared.ru/slide/662762/ (опубликовано 11.12.2013).

11. Katarina Wolf, Wu Yi I., Liu Yueying, Geiger Jӧrg, Tam Eric, Overall Christopher, Stack M. Sharon, Friedl Peter. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion. Nature Cell Biol. 2007; 9(8): 893-904.

12. Sanford K.W., Balogun R.A. Therapeutic apheresis in critically ill patients. J. Clin. Apher. 2011; 26(5): 249-251.

Ведущую роль в острофазовом ответе играют изменения в протеолитических медиаторных системах крови: калликреин-кининовой, комплемента, свертывания и фибринолиза. Они составляют единую полисистему крови и практически полностью состоят из трипсиноподобных сериновых протеиназ, имеющих преимущество в биохимических взаимодействиях в связи с небольшими энергетическими затратами [5, 10]. Протеиназы трипсинового типа серинового ряда включают большой перечень узко- и широкоспециализированных белков, которые содержатся в крови и тканях, освобождаются из клеток при дегрануляции. Важность исследования сериновых протеиназ обусловлена тем, что они оказывают влияние на ряд важнейших биохимических систем в плазме крови, клетках и эндотелии, а также в клетках тканей и могут играть решающую роль в воспалении, которое сопровождает многие патологические процессы, в том числе онкологические. Практически все воспалительные реакции опосредованы действием токсинов, медиаторов различной природы и характеризуются совокупностью процессов эндотоксикоза с переходом в полиорганную недостаточность [9]. В процессе формирования синдрома системного воспалительного ответа организм теряет способность его регулировать. Причины этого пока не выяснены.

Для более полной характеристики метаболизма сериновых протеиназ крови в условиях подготовки больных к панкреатодуоденальной резекции (ПДР) большое значение имеют исследования белков-ингибиторов, регулирующих протеолиз.  Особого внимания заслуживает определение α-2-макроглобулина(α₂М) и α-1-протеиназного ингибитора(α₁ПИ), поскольку первый - универсальный ингибитор практически всех известных протеиназ (сериновых, тиоловых, кислых, металлопротеиназ) с наибольшим сродством к калликреину, плазмину и эластазе, а второй обеспечивает 90% ингибиторной емкости крови, контролируя трипсиноподобные, гранулоцитарные и другие протеиназы (плазмин, трипсин, ренин, эластазу, коллагеназу, факторы свертывания, калликреин и др.) с наименьшим сродством к калликреину. Синтез трипсиновых протеиназ и обоих ингибиторов осуществляется в основном в печени, в меньшей степени - в поджелудочной железе и клетках крови. Оба ингибитора являются индикаторами острой фазы воспаления наряду с быстрореагирующими сериновыми протеиназами [7, 10].

Цель работы

Изучение динамики общей активности трипсиновых протеиназ, основных кининогеназ и универсальных ингибиторов плазмы крови в период подготовки больных раком головки поджелудочной железы (РГПЖ) к ПДР.

Материалы и методы исследования

Использовались методы клинического наблюдения, биохимических исследований и статистического анализа в Microsoft Office Excel 2010. Разрешение этического комитета РНИОИ на использование крови пациентов для научных целей получено перед началом работы. Исследовалась цитратная плазма крови от 39 больных РГПЖ, поступивших на лечение в  РНИОИ и ранее перенесших чрескожную чреспеченочную холангиостомию (ЧЧХС) по Сельдингеру по поводу механической желтухи (МЖ), вызванной РГПЖ (22 мужчины, 17 женщин, 45-76 лет, Т_2-4N₀M₀). Аппаратный плазмоферез (АПФ) проводился вторым этапом подготовки к ПДР, плазма крови исследовалась после процедуры: в 1-е, 14-е, 30-е сутки (непосредственно перед ПДР), а также в 1-е сутки после ПДР. Кинетику ферментативных реакций ККС плазмы крови до и после ЧЧХС определяли по скорости гидролиза этилового эфира N-α-бензоил-L-аргинина и гиппурил-L-лизина, активность ингибиторов - методами ИФА с использованием стандартных тест-наборов. Полученные данные сравнивали с результатами исследования плазмы крови 39 практически здоровых доноров. Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента, принимая р≤0,05 как статистически значимый.

Результаты и их обсуждение

Первым этапом подготовки больных к ПДР являлась ЧЧХС, результаты которой освещены ранее [8]. Следующим этапом (через 2 недели) проводили АПФ, через 1 месяц - ПДР. В настоящем сообщении в таблицах 1, 2, 3 представлены результаты исследования трипсиновых протеиназ, калликреин-кининовой системы (ККС) и универсальных ингибиторов плазмы крови за период с 1-х суток после АПФ до 1-х суток после ПДР включительно.

Из анализа протеолиза и кининогенеза очевидно, что процедура АПФ не снижала их активности, данные 1-х суток наблюдения свидетельствуют о достоверном усилении этих процессов сравнительно с первым этапом подготовки. Исключение составила КОП, которая практически не менялась сравнительно с 1-ми сутками после ЧЧХС. Последствия МЖ были ликвидированы ЧЧХС, состояние больных улучшилось, АПФ должен был завершить результат. Вопреки нашим ожиданиям после детоксикации обнаружено резкое усиление протеолиза (табл. 1). Анализ активности ферментов в 1-е сутки после процедуры показал сохранение их дисбаланса (табл. 3). В изменениях коэффициентов «общие трипсиновые протеиназы/общий калликреин» (ОТП/ОК) и «общий прекалликреин/общий калликреин» (ОПК/ОК) достоверных различий с предыдущим сроком не установлено, только ОК/КОП - достоверно повышался за счет роста общего калликреина. С точки зрения многофакторной активации калликреин-кининовой системы (ККС) это объяснимо, поскольку в циркуляции еще сохранялись активирующие белки, иммунные комплексы, раковые токсины, клетки крови и т.д.

Таблица 1

Трипсиновые протеиназы и кининовая система в плазме крови больных раком поджелудочной железы

Таблица  2

Универсальные ингибиторы плазмы крови больных раком поджелудочной железы

Примечание к таблицам 1 и 2: достоверность определяли к каждому предыдущему сроку исследования и плазме крови доноров (р≤0,05). Индекс достоверности соответствует номеру колонки, с которой сравнивали цифровые данные.

Таблица 3

Примечание к таблице 3: достоверность различий определяли к каждому предыдущему сроку исследования и плазме крови доноров (р<0,05). Индекс достоверности соответствует номеру строки, с которой сравнивали цифровые данные.

Вне организма в процессе осуществления АПФ при общем положительном действии детоксикации отрицательно заряженные поверхности оказывали активирующее действие на калликреины и остальные острофазовые белки [7, 10]. Не исключена травма клеток крови, которые возвращались в организм [12], что также влияет на состояние белков крови. Положительным моментом можно было бы считать сохранение содержания ОПК в 1-е сутки после АПФ и дальнейшее его увеличение (табл. 1). Тем не менее при возросшей активности ОК, постоянной активности кининазы 1 (карбоксипептидазы N, КОП) количество свободного брадикинина и время его существования в крови возрастало, что влекло за собой вполне определенные последствия: падение АД, увеличение кровенаполнения сосудов микроциркуляторного русла, изменение реологических свойств крови, нарушение барьерных функций тканей, активацию и дегрануляцию лейкоцитов и т.д.

Метаболические нарушения ферментов, нарушение барьерных функций тканей и органов в результате изменения гемодинамики и микроциркуляции, нарушение детоксикационной функции печени в силу  МЖ и ее последствий вкупе ведут к токсемии, что вновь усугубляет картину ферментных нарушений [3, 9]. В результате  даже после ЧЧХС и при успешном проведении АПФ процесс идет по замкнутому кругу, это подтверждают и результаты настоящего исследования.

ПДР планировалась через 1 месяц после АПФ, и в течение этого времени, кроме 1-х суток, проведены еще две регистрации состояния метаболизма острофазовых белков крови у пациентов, находившихся под наблюдением, - в 14- и 30-дневный сроки. Через 2 недели после АПФ общая активность трипсиновых протеиназ резко снижалась при сохранении нормального запаса ОПК и росте ОК. Процентное содержание активных калликреинов в ОТП возрастало до 45,3% при значительном снижении остальных протеиназ (табл. 1). Трипсиновые протеиназы без учета калликреинов (ТП) были достоверно менее активны, чем в норме, что, несомненно, являлось положительным признаком. Повышение ОТП в этот срок состоялось исключительно за счет увеличения общего калликреина. Мы предполагаем, что снижение активности протеолиза началось ранее, скорее всего на 7-10-е сутки после АПФ, когда завершаются адаптационные процессы после проведенного лечебного мероприятия, а на 14-й день наступил максимально возможный при патологии «покой» в белковом метаболизме. Однако при наличии злокачественного процесса эта ситуация не могла стабилизироваться, поскольку продолжалось воздействие опухоли на организм, и это доказывают последующие наблюдения.

Накануне ПДР, через 30 дней после АПФ, наблюдался резкий рост активности протеолиза, причем активация шла как со стороны калликреинов, так и остальных трипсиновых протеиназ (табл. 1). Запасы ОПК также резко возросли, но КОП по-прежнему не изменялась. Наблюдаемые изменения в системе протеолиза способствовали увеличению в кровотоке количества вазоактивных веществ (в данном случае кининов), это вело к дальнейшим изменениям кровообращения, микроциркуляции, повышению проницаемости сосудистой стенки, угнетению тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, что углубляет эндотоксикоз. В 1-е сутки после ПДР в небольшой степени снижалась только активность системы ОПК-ОК, все остальные ферменты оставались без изменений, коэффициенты ферментативного баланса удерживались на патологическом уровне (табл. 1, 3).

Анализ системы универсальных ингибиторов показал непродолжительное время стабильно повышенной ингибиторной емкости крови: в 1-е сутки после АПФ (это 15-й день после ЧЧХС) она еще сохранена (табл. 2). В последующие сроки наблюдения только α₂М оставался увеличенным, а содержание α₁ПИ постепенно и достоверно снижалось, не достигая даже фоновых [8] значений перед ПДР и возрастая до нормы в 1-е сутки после ПДР.

Сохранение в циркуляции α₂М на высоком уровне в течение всего наблюдения (табл. 2) хотелось бы считать положительным признаком, повышающим потенциал эндогенной защиты через связывание калликреина, плазмина, трипсина, эластазы, коллагеназ, металлопротеиназ и других ферментов. Однако существуют данные о способности злокачественных опухолей синтезировать и выделять в окружающую среду собственный α₂М, защищающий опухоль от атак иммунной системы [4]. В этой связи достоверное снижение ингибитора в 1-е сутки после ПДР подтверждает его «опухолевое» происхождение и вряд ли может рассматриваться как свидетельство защиты организма, тем более что общая ингибиторная емкость не соответствовала высокой активности протеолиза: коэффициенты К/α₂М и ТП/α₁ПИ в этот срок многократно превышали нормативные значения (табл. 3).

Белок α₁ПИ - положительный реактант острой фазы воспаления, ингибитор тромбина, плазмина, трипсина, химотрипсина и некоторых ферментов системы свертывания [1, 5]. Его количество увеличивается при воспалительных заболеваниях, распаде клеток. Угнетение функциональной активности печени, ее детоксикационной функции сопровождается снижением уровня α₁ПИ в крови [2]. Считается, что недостаток этого белка способствует переходу острых заболеваний в хронические, прогрессии злокачественных заболеваний [1, 6, 11]. В данном случае снижение количества α₁ПИ через 1 месяц после АПФ, непосредственно перед ПДР (табл. 2), может способствовать хронизации эндотоксемии, что снизит эффективность эндогенной защиты во время и после ПДР, усугубит тяжесть состояния больного, возможно, создаст условия для развития осложнений.

В итоге, после каждого из двух этапов подготовительных процедур  больных РГПЖ (ЧЧХС и АПФ) рост ингибиторной емкости крови наблюдался только в 1-е сутки, при сохранении [8] и активации (табл. 1, 2) протеолиза.

Печень является центральным органом детоксикации в организме, так как осуществляет преобразование токсичных веществ в нетоксичные метаболиты благодаря процессам гидролиза, окисления-восстановления, конъюгации, происходящих в гепатоцитах. Нарушения функций последних, вызванные МЖ, сохраняются в течение длительного времени и после ее устранения. Обнаруженные нами ранние положительные изменения белкового состава крови связаны с реакцией острофазовых белков, свидетельствующей о самом начале адаптационных процессов на молекулярном уровне [5]. Далеко не всегда организм-опухоленоситель может сохранить стабильность адаптационно-защитных систем собственными силами. Только комплексная детоксикация с коррекцией гомеостаза может разорвать замкнутый круг формирования эндотоксикоза, уменьшить количество осложнений и летальность. Детоксикационная терапия при подготовке больных к ПДР должна быть направлена ​​на восстановление и усиление функции основного органа детоксикации, что в первую очередь проявляется на молекулярном уровне, при исследовании острофазовых белков.

Наблюдение динамики острофазовых белков в период подготовки больных к ПДР показало наименьшую активность протеолиза и сохранение нормального содержания прекалликреина только к 14-му дню после АПФ (табл. 1). Выработка прекалликреинов является высокочувствительным тестом, характеризующим белковосинтетическую функцию печени, которая угнетается при патологическом состоянии органа и первой восстанавливается после лечения, что уже освещалось в трудах Г.А. Яровой и других исследователей. Увеличение ОПК в последующие сроки наблюдения может, с одной стороны, подтверждать это положение, с другой - нельзя исключить секрецию злокачественной опухолью различных белков, в том числе и этих. Стабильно высокая активность ОК в этот период может быть связана с реакцией организма на наличие злокачественной опухоли в организме, к тому же используемый метод позволяет определять общее количество фермента, в том числе и связанного с α₂М, поскольку в этом случае блокируется только протеолитическая его активность. Увеличенное содержание α₂М (в 2,2 раза от нормы на 14-й день и последующее увеличение), по-видимому, способно в значительной степени блокировать кининогеназную активность ОК. Однако, если часть ингибитора имела опухолевое происхождение, то его искаженные свойства могли и препятствовать осуществлению контроля кининогенеза, что более вероятно. Протеиназо-ингибиторный баланс крови был нарушен на протяжении всего наблюдения, за исключением 14 суток после АПФ (табл. 3). В условиях раковой интоксикации в циркуляции содержится множество белков, в том числе протеиназ и ингибиторов, модифицированных опухолью, которые не выполняют свои функции [11]. Наивысшее содержание α₁ПИ, наблюдаемое сразу после ЧЧХС и зарегистрированное в 1-е сутки после АПФ, к 14-м суткам не сохранилось (табл. 2), но, во-первых, это могло быть следствием нормализации ТП, а во-вторых, коэффициент их баланса ТП/α₁ПИ в этот срок соответствовал таковому у доноров (табл. 3), что все же свидетельствует о еще достаточном контроле трипсиновых протеиназ к 14-м суткам после АПФ.

Таким образом, резкая активация протеолиза в плазме крови больных РГПЖ к 30-му дню наблюдения (накануне ПДР), сохранение высокого α-2М и падение α-1ПИ ниже фоновых цифр [8] свидетельствуют о потере протеиназо-ингибиторного равновесия в сроки, превышающие 2-недельный период после АПФ. В следующий 2-недельный период, перед ПДР, в организме-опухоленосителе уже преобладали процессы деградации и интоксикации, что увеличивало опасность осложнений в послеоперационный период.

Нарушения в системе протеолиза способствовали увеличению в кровотоке количества вазоактивных веществ (в данном случае кининов), что вело к дальнейшим изменениям кровообращения, микроциркуляции, повышению проницаемости сосудистой стенки, угнетению тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, что углубляет эндотоксикоз. Повышение вязкости крови, агрегация эритроцитов замедляли кровоток, усиливали нарушение микроциркуляции и вели к депонированию крови в тканях. Эти нарушения могли привести к развитию ДВС-синдрома или, как минимум, к тромбозу, которому особенно подвержены сосуды нижних конечностей [9]. Послеоперационные тромбозы в более поздние сроки послеоперационного периода регистрировались у 12 больных (30,8%), из них у 10 - нижних конечностей, 2 случая - с летальным исходом (тромбоэмболия легочной артерии). Есть все основания связывать эти осложнения с наблюдаемым дисбалансом в отношениях «фермент-фермент» и «фермент-ингибитор» системы многочисленных трипсиноподобных протеиназ накануне ПДР.

Заключение

Временная холангиостома обеспечивает непродолжительное (до 4 недель) наружное отведение желчи, что сразу улучшает состояние больных. Это считается достаточным для подготовки к ПДР больного с РГПЖ и механической желтухой, что подтвердила и наша предыдущая публикация [Франциянц Е.М. и соавт., 2015]. Однако наблюдение той же группы больных в динамике показало, что необходимо и проведение АПФ, поскольку нормализация активности протеолиза в плазме крови формируется только к концу второй недели после этой процедуры. К этому же сроку уменьшается активность α₁ПИ, которому давно придается большое значение в мобилизации противоопухолевой защиты [6]. Последующая динамика α-1ПИ свидетельствует о том, что эндогенный белок угнетается токсинами опухоли [1, 11]. Достоверное снижение α-2М в 1-е сутки после ПДР подтверждает, что часть его имела опухолевое происхождение.

И ЧЧХС, и АПФ оказывают ожидаемое действие на состояние крови и печени, но при наличии злокачественной опухоли эффект не может наступить сразу и быть продолжительным. По итогам настоящего исследования при составлении плана подготовительных процедур перед ПДР (ЧЧХС, АПФ) следует учитывать приведенные результаты и планировать ПДР не позднее 10-14-го дня после АПФ, а не через 1 месяц, как осуществлялось ранее.

Рецензенты:

Геворкян Ю.А., д.м.н., профессор, отделения OAO-2 ФГБУ РНИОИ МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Непомнящая Е.М., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник «Лаборатории иммунофенотипирования опухолей» ФГБУ РНИОИ МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону.

Библиографическая ссылка