Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Плотников А.Н. 1 Тумилович Е.Ю. 1 Вихарева Е.В. 1 Рычкова М.И. 2

---

1 ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздрава России

2 ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН

Установлены условия количественного определения компонентов комплексного лекарственного средства Но-шпалгин в присутствии продуктов их биологической деструкции в культуральных жидкостях родококков методом высокоэффективной жидкостной хроматографии: элюент ацетонитрил – фосфатный буферный раствор (рН 3); градиентный режим элюирования; скорость потока элюента – 1 мл/мин; температура колонки – 40˚С; объем вводимой пробы – 10 мкл; детектирование при длинах волн 220 нм и 240 нм. Показано, что на 30-е сутки процесса биодеструкции препарата Но-шпалгин содержание парацетамола в культуральной жидкости родококков составило 77,9%, дротаверина гидрохлорида – 21,2%, кодеина фосфата – 27,4%. Среди продуктов биодеструкции исследуемого лекарственного средства детектированы метаболиты парацетамола: п-аминофенол, гидрохинон, п-бензохинон, пирокатехин.

Статья в формате PDF

185 KB

актинобактерии рода Rhodococcus

биологическая деструкция

кодеин

дротаверин

парацетамол

Но-шпалгин

ВЭЖХ

1. Вихарева Е.В., Мишенина И.И., Ившина И.Б., Рычкова М.И. Влияние вспомогательных веществ, входящих в состав таблеток парацетамола, на процесс его биодеструкции. Вопросы медицинской, биологической и фармацевтической химии. – 2008. – № 3. – С. 25–28.

2. Вихарева Е.В., Плотников А.Н., Мухутдинова А.Н., Мишенина И.И., Поспелова А.А., Тумилович Е.Ю. Идентификация компонентов комплексного лекарственного средства Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков. Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9 (часть 5). – С. 1032–1037.

3. Государственная фармакопея Российской Федерации XII: официальное издание. Ч. 1. – М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения. – 2008. – С. 445.

4. Мишенина И. И. Разработка биотехнологического способа утилизации непригодных к медицинскому использованию лекарственных средств, производных фенола: дис. канд. фармац. наук. – Пермь, 2008. – 156 с.

5. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]: официальный сайт. – Электрон. дан. – Режим доступа: http://www.rlsnet.ru / (дата обращения: 25.07.2014);

6. Тюмина Е.А., Зязева В.А., Тумилович Е.Ю., Рычкова М.И., Вихарева Е.В. Интенсификация процесса биодеструкции кодеина фосфата // Современные тенденции и перспективы развития фармацевтического образования и науки в России и за рубежом: материалы науч.-практ. конф. с международным участием (Пермь, 21–23 ноября 2013 г.). – Пермь, 2013. – С. 156–158.

7. Catalogue of Strains of Regional Specialized Collection of Alcanotrophic Microorganisms. [Электронный ресурс] URL: http:// www.iegm.ru/iegmcol/strains (дата обращения 15.07.2015).

8. Gauthier, H. Biodegradation of Pharmaceuticals by Rhodococcus rhodochrous and Aspergillus niger growing by Co-Metabolism / H. Gauthier, V. Yargeau, D. Cooper // Science of the Total Environment. – 2010. – V. 408. – P. 1701–1706.

9. Ivshina I. B. Biodegradation of drotaverine hydrochloride by free and immobilized cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 608/Ivshina I. B., Vikhareva E. V., Richkova M. I., Mukhutdinova A. N., Karpenko Ju. N.// World J. Microbiol. Biotechnol. – 2012. V. 28. – P. 2997–3006.

Но-шпалгин – комбинированное лекарственное средство (ЛС) анальгезирующего действия, содержащее парацетамол, дротаверина гидрохлорид (ДГ) и кодеина фосфат (КФ) [5]. В ранее проведенных нами исследованиях установлены оптимальные условия идентификации компонентов препарата Но-шпалгин, а также продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков методом тонкослойной хроматографии [2]. Сведения о возможности количественного определения компонентов исследуемого препарата и продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях микроорганизмов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) отсутствуют.

Цель настоящего исследования

Разработать условия количественного определения компонентов препарата Но-шпалгин в присутствии продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков методом ВЭЖХ.

Материалы и методы исследования

В работе использовали таблетки Но-шпалгин массой 0,65 г (ЗАО «Хиноин», Будапешт, Венгрия) состава: парацетамола 500 мг, дротаверина гидрохлорида 40 мг, кодеина фосфата (в форме гемигидрата) 8 мг и 10% вспомогательных веществ (кислота аскорбиновая, железа оксид желтый (E172), повидон, магния стеарат, кросповидон, тальк, крахмал кукурузный, карбоксиметилцеллюлоза).

Биодеструкцию исследуемого ЛС проводили в условиях периодического культивирования (160 об/мин, 28оС) в колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл минеральной среды RS [4], в течение 90 суток. Перед внесением в среду RS таблетки измельчали. Во избежание фотоинициированного окисления ДГ содержимое колб защищали от действия света с помощью светонепроницаемого материала. В качестве штаммов-биодеструкторов использовали Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 767 и Rhodococcus rhodochrous ИЭГМ 647 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ, номер во Всемирной федерации коллекции культур 768) [7]. Ранее было показано, что штамм R. erythropolis ИЭГМ 767 является наиболее эффективным катализатором процесса биодеструкции парацетамола [1], а штамм R. rhodochrous ИЭГМ 647 наиболее резистентен к дротаверину и кодеину [6, 9]. Бактериальные клетки используемых в работе штаммов вносили в минеральную среду RS, содержащую Но-шпалгин, в виде инокулята (107 клеток/мл). Поскольку при одновременном внесении данных штаммов происходит взаимное ингибирование их каталитической активности, а также адсорбция дротаверина на осадке образующихся продуктов разложения парацетамола, то процесс биодеструкции Но-шпалгина инициировали внесением клеток R. rhodochrous 647 с последующим добавлением (через 15 суток) клеток R. erythropolis ИЭГМ 767.

Пробоподготовку культуральных жидкостей (2 мл), отобранных на 30-е сутки процесса биодеструкции Но-шпалгина, осуществляли посредством центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 мин («Mini Spin», Германия). Супернатант фильтровали через мембранный фильтр (Agilent Technologies, США) с диаметром пор 0,2 мкм.

В качестве контролей использовали (1) стерильный раствор Но-шпалгина в минеральной среде RS (абиотической контроль); (2) стерильный раствор Но-шпалгина в минеральной среде RS с инактивированными клетками родококков (для оценки степени адсорбции компонентов на инактивированных бактериальных клетках (120оС, 20 мин); (3) минеральную среду RS с клетками родококков без ЛС (биотический контроль).

В качестве модельной смеси использовали метанольный раствор, содержащий парацетамол (5 мг/мл), КФ (0,08 мг/мл) и ДГ (0,4 мг/мл). В качестве свидетелей продуктов биодеструкции Но-шпалгина применяли растворы п-аминофенола, гидрохинона, бензохинона и пирокатехина (Merck, Германия) в абсолютном метиловом спирте с концентрацией 50 мкг/мл. Другие химические реагенты (х.ч., ч.д.а., о.с.ч.) были получены от отечественных фирм–производителей. Количественное определение содержания компонентов исследуемого ЛС в культуральных жидкостях родококков проводили методом абсолютной калибровки. Ввиду большой продолжительности лабораторных экспериментов полученные значения корректировали с учетом поправки на испарение воды с помощью уравнений, приведенных в работе Gauthier et al. [8].

Хроматографический анализ проводили с использованием хроматографа «Shimadzu LC Prominence» (Shimadzu, Япония), оборудованного колонкой из нержавеющей стали Luna 5u С 18 100А 250×4,6 мм, предколонкой Discovery® 2 см × 4,00 мм, в комплектации с насосом LC-20AD (рабочее давление до 20 Мпа), диодно-матричным детектором SPD-M20A, автодозатором SIL-20A/20AC и колоночным термостатом CTO-20A/20AC. Для управления системами хроматографа и получаемыми данными использовали программное обеспечение LC solution. Хроматографирование проводили в изократическом и градиентном режимах со скоростью потока элюента 1 мл/мин. В изократическом режиме в качестве подвижных фаз использовали ацетонитрил в смеси с бидистиллированной водой, а также фосфатными буферными растворами (рН 3 и рН 7) [3] в соотношениях, представленных в таблице 1.

Таблица 1

Подвижные фазы, использованные для хроматографирования компонентов модельной смеси в изократическом режиме элюирования

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что в условиях изократического режима элюирования компонентов модельной смеси, содержащей парацетамол, КФ и ДГ, пики исследуемых веществ имели асимметричную форму. Кроме того, не наблюдалось полного разделения пиков парацетамола и кодеина. Варьирование количества ацетонитрила в составе подвижной фазы также не позволило получить пики исследуемых веществ симметричной формы с пригодным для анализа временем удерживания. Поэтому для эффективного разделения компонентов модельной смеси применили градиентный режим элюирования. Установлено, что оптимальным является градиент с использованием подвижной фазы состава ацетонитрил –фосфатный буферный раствор (рН 3) при скорости потока элюента 1 мл/мин. Условия подачи подвижной фазы: с 0 до 7 мин – содержание ацетонитрила 10%, с 7 до 12,50 мин – увеличение концентрации ацетонитрила до 90%, к 13,50 мин – увеличение концентрации ацетонитрила до 95%, с 13,50 до 14,60 мин – изократический участок, с 14,61 мин – содержание ацетонитрила 10%.

Градиентный режим обеспечивает более полное и качественное разделение исследуемых веществ, чем изократический, а также сокращение времени их разделения до 20 мин, о чем свидетельствует хроматограмма модельной смеси, содержащей стандартные растворы парацетамола, ДГ и КФ в концентрациях, соответствующих их содержанию в препарате Но-шпалгин (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси стандартных растворов парацетамола, дротаверина гидрохлорида и кодеина фосфата

А Б

В

УФ спектры парацетамола, КФ и ДГ имеют максимумы поглощения при длинах волн 244 нм, 211 нм и 243 нм соответственно (рис. 2).

Рис. 2. УФ спектры парацетамола (А), кодеина фосфата (Б) и дротаверина гидрохлорида (В) в подвижной фазе: ацетонитрил – фосфатный буферный раствор (рН 3,0)

Следовательно, детектирование компонентов Но-шпалгина в культуральной жидкости родококков рационально проводить при длине волны 220 нм (кодеин) и 240 нм (парацетамол, дротаверин). Идентификацию продуктов биодеструкции (гидрохинона, пирокатехина, п-аминофенола) в соответствии с данными [4] также необходимо осуществлять при λ=220 нм, бензохинона – при λ=240 нм.

Таким образом, установлены следующие условия количественного определения ингредиентов препарата Но-шпалгин и детектирования их метаболитов методом ВЭЖХ в постферментационной среде культивирования родококков: состав элюента – ацетонитрил-фосфатный буферный раствор (рН 3); градиентный режим элюирования; скорость потока элюента – 1 мл/мин; температура колонки – 40˚С; объем вводимой пробы – 10 мкл; детектирование при длинах волн 220 нм и 240 нм. Результаты количественного определения компонентов препарата Но-шпалгин и детектирования продуктов их разложения в образцах культуральной жидкости родококков, отобранных на 30-е сутки процесса биодеструкции, с использованием градиентного варианта ВЭЖХ представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Хроматограммы компонентов препарата Но-шпалгин и их метаболитов в культуральной жидкости родококков через 30 суток процесса биодеструкции.

А — абиотический контроль; Б — культуральная жидкость родококков

В таблице 2 представлены параметры идентификации компонентов препарата Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции с использованием градиентного варианта ВЭЖХ.

Таблица 2

Параметры идентификации компонентов препарата

Но-шпалгин и продуктов их биодеструкции в культуральных жидкостях родококков

Библиографическая ссылка