Как известно, большинство бактерий существует в виде биопленок, образуемых на самых разных биотических и абиотических поверхностях. Развитие биопленочных сообществ – одна из основных стратегий выживания бактерий не только в организмах инфицируемых хозяев, но и в окружающей среде [3]. В составе биопленок бактерии отличаются значительной устойчивостью к действию антибактериальных препаратов, включая антибиотики и факторы иммунной защиты организма, а также к воздействию факторов окружающей среды, таких как изменения температуры, рН среды, осмолярности. Выживаемость бактерий биопленочных сообществ в различных стрессовых условиях обеспечивается сложной структурной организацией биопленок [8].
Основным фактором устойчивости биопленок является экзополисахаридный матрикс, вырабатываемый клетками бактерий сразу после прикрепления к субстрату. Он непостоянен по составу и меняется в результате адаптации бактерий к условиям окружающей среды, основу его составляют экзополисахариды, липополисахариды, гликопротеины и протеогликаны [4,9]. Эти биополимеры в микробной пленке действуют как молекулярное сито, улавливая и концентрируя питательные вещества из окружающей среды, а также ограничивая проникновение агрессивных агентов к бактериям в глубине биопленки [7].
Механизм и особенности формирования биопленок у холерных вибрионов в эксперименте достаточно хорошо изучены [5,10]. Однако свойства холерных вибрионов при персистенции их в биопленках и влияние на процесс их образования различных стрессорных факторов исследованы недостаточно [1,2,6]. Мало изучен вопрос о роли низкотемпературного стресса в выживании планктонных и биопленочных форм холерных вибрионов различной эпидемической значимости в воде открытых водоемов, а эти сведения чрезвычайно важны при планировании мероприятий по эпиднадзору за холерой в Российской Федерации.
Цель исследования: с учетом значимости проблемы выяснения закономерностей персистенции холерных вибрионов различной эпидемической значимости в воде открытых водоемов провести масштабные по продолжительности эксперименты (9 месяцев) по оценке влияния стрессовых температурных условий на процесс биопленкообразования.
Материалы и методы: в работе использовано 22 штамма Vibrio cholerae Эль Тор, имеющих различный набор детерминант патогенности, выделенных от больных, вибриононосителей и из речной воды. Для решения поставленных задач холерные вибрионы инкубировали в стерильной речной воде (конечная концентрация 1*107 м.к./мл) в холодильнике при +40С и в комнатном термостате при +220С в течение 9 месяцев, а также (при моделировании условий пребывания возбудителя холеры в речной воде в летнее, осеннее, зимнее время) эксперимент продолжали 2 месяца при 22 0С, 2 месяца – при 10 0С, 5 месяцев – при 4 0С. Ежемесячно производили высевы на агар Мартена для определения количества планктонных форм холерных вибрионов, а также определяли оптическую плотность биопленок на спектрофотометре Cary50.
Результаты исследования
В первой серии опытов, проводимых с использованием речной воды (таблица 1, рисунок 1), установлено, что у токсигенных (ctx+tcp+) штаммов при 22 0С на протяжении всего срока исследования количество клеток в популяции, начиная с конца первого месяца эксперимента, постепенно снижалось (20 %→0,15 %), при этом вибрионы формировали «слабые» биопленки (значения оптической плотности (ОП) были низкими и лишь незначительно увеличивались к 4–5 месяцу исследования). При стрессовой низкой температуре (4 0С) все токсигенные штаммы практически отмирали к 3 месяцу исследования (выжившие клетки при этой температуре составляли всего десятые доли процента, возможно часть популяции при этом переходила в некультивируемое состояние. Сведения о такой возможности приводятся в работах Е.С. Куликаловой с соавт. [5,6]. Кроме этого, показано, что при 4 0С токсигенные холерные вибрионы формировали через 1–2 месяца, наряду с типичными колониями, «ругозные» варианты, которые постепенно отмирали в стрессовых условиях.
Таблица 1
Средние значения выживаемости холерных вибрионов в речной воде в течение 9 месяцев при 22ºС и 4ºС
|
срок культиви-рования, месяцы |
Ранжирование штаммов по эпидемической значимости |
|||||||||||
|
Температура культивирования 22ºС |
Температура культивирования 4ºС |
|||||||||||
|
ctx+tcp+ |
ctx-tcp+ |
ctx-tcp- |
ctx+tcp+ |
ctx-tcp+ |
ctx-tcp- |
|||||||
|
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
|
|
1 |
2*106 |
20 |
6,4*106 |
64 |
3*106 |
30 |
2,2*105 |
2,2 |
5,5*106 |
55 |
5*106 |
50 |
|
2 |
1*105 |
1 |
5*106 |
50 |
2,7*106 |
27 |
1,2*104 |
0,12 |
4,2*106 |
42 |
3,6*106 |
36 |
|
3 |
1*105 |
1 |
3*106 |
30 |
1,4*106 |
14 |
0 |
0 |
3*106 |
30 |
2*106 |
20 |
|
4 |
1*105 |
1 |
4,5*106 |
45 |
1,8*106 |
18 |
0 |
0 |
3,5*106 |
35 |
2*106 |
20 |
|
5 |
4*104 |
0,4 |
3*106 |
30 |
1*106 |
10 |
0 |
0 |
3*106 |
30 |
1,5*106 |
15 |
|
6 |
3,5*104 |
0,35 |
2,6*106 |
26 |
8*105 |
8 |
0 |
0 |
6*105 |
6 |
9*105 |
9 |
|
7 |
2*104 |
0,2 |
1,5*106 |
15 |
3*105 |
3 |
0 |
0 |
5,6*105 |
5,6 |
1*106 |
10 |
|
8 |
1*104 |
0,1 |
1*106 |
10 |
2*105 |
2 |
0 |
0 |
5*105 |
5 |
7,5*105 |
7,5 |
|
9 |
1,5*104 |
0,15 |
1*106 |
10 |
1,5*105 |
1,5 |
0 |
0 |
7*104 |
0,7 |
5*105 |
5 |
Рисунок 1. Сравнение уровней биопленкообразования у вибрионов Эль Тор в речной воде при 22 ºС и 4 ºС в течение 9 месяцев
У атоксигенных (ctx-tcp-) вибрионов, напротив, бóльшая часть популяции сохранялась при 4ºС на протяжении всего срока исследования (к концу 9 месяца показатели биопленкообразования были выше, чем в тех же условиях при 22ºС). То же касается и выживаемости – она была выше в холодной воде (5 % против 1,5 %).
Потенциально эпидемически опасные вибрионы (ctx-tcp+) сохранялись при обеих температурах на протяжении всего срока исследования, но продукция экзополисахарида была гораздо выше при 22 ºС. В процессе культивирования при 4 ºС уровень биопленкообразования этих штаммов несколько увеличивался к 4 месяцу, а затем существенно снижался. К концу 9 месяца при 22 ºС выживало 10 % популяции клеток (наиболее высокий показатель среды всех изучаемых вибрионов), при 4 ºС – всего 0,7 % (но это значение всего в 7 раз ниже, чем у нетоксигенных штаммов. Это свидетельствует о достаточно высоком персистентном потенциале ctx-tcp+ вариантов.
Для выяснения «судьбы» холерных вибрионов различной эпидемической значимости при попадании в речную воду в летнее время был проведен длительный эксперимент по моделированию условий пребывания в ней холерных вибрионов Эль Тор в летнее, осеннее, зимнее время при разных температурах (2 месяца – 22 ºС, 2 месяца – 10 0С, 5 месяцев – 4 ºС). Результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 2.
Таблица 2
Средние значения выживаемости холерных вибрионов в речной воде при различных температурах в разные сроки
|
Наличие генов |
Температура |
|||||||||||||||||
|
22 ºС |
10 ºС |
4 ºС |
||||||||||||||||
|
Месяцы |
||||||||||||||||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
||||||||||
|
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
абс. |
% |
|
|
ctx+tcp+ |
2*106 |
20 |
1,2*105 |
1,2 |
6,1*103 |
0,06 |
9*101 |
0,00 09 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
ctx-tcp+ |
6,4*106 |
64 |
5*106 |
50 |
6,4*105 |
6,4 |
5*105 |
5 |
1,3*105 |
1,3 |
8,2*104 |
0,82 |
6*104 |
0,6 |
4,4*104 |
0,44 |
3,2*104 |
0,32 |
|
ctx-tcp- |
3*106 |
30 |
2,5*106 |
25 |
4*105 |
4 |
4,6*105 |
4,6 |
2*105 |
2 |
2,8*105 |
2,8 |
2,4*105 |
2,4 |
2*105 |
2 |
1,8*105 |
1,8 |
Рисунок 2. Биопленкообразование вибрионов Эль Тор в речной воде в течение 9 месяцев при изменении температуры культивирования
Токсигенные холерные вибрионы при постепенном снижении температуры выживали только при температурах 22 ºС и 10 ºС (при этом к концу 4 месяца высевалось лишь 0,0009 % клеток), при 4 ºС живых клеток обнаружено не было. Снижение количества живых вибрионов в речной воде коррелировало со снижением показателей биопленкообразования (показатели ОП на всем протяжении были низкими, и после 4 месяцев были отрицательными, т.е. биопленки отсутствовали).
Атоксигенные штаммы сохранялись на протяжении всего эксперимента, хотя количество клеток к концу исследования было сравнительно невелико (0,8 % от исходного показателя). Что же касается биопленок, то их значения в этой группе штаммов к концу исследования при 4 ºС были выше, чем в начале эксперимента, вероятно, в результате адаптации к стрессовым условиям обитания.
Высоко устойчивыми к стрессу оказались потенциально эпидемически опасные штаммы, лишенные генов токсинообразования, но способными их приобрести при определенных условиях за счет токсинкорегулируемых пилей алгезии. Эти вибрионы выживали на протяжении всего срока исследования (хотя к концу эксперимента сохранилось всего 0,3 % планктонных клеток). На протяжении 7 месяцев персистирования в воде при разных температурах эти штаммы формировали самые «мощные» биопленки (показатели ОП – самые высокие), затем значения постепенно снижались.
Таким образом, можно констатировать, что эпидемически значимые токсигенные холерные вибрионы в условиях стерильной речной воды достаточно быстро (в течение 2–3 месяцев) погибают, гибель идет тем быстрее, чем ниже температура. Показатели выживания коррелируют с показателями биопленкообразования, т.к. ctx+tcp+ варианты не формируют в условиях низкотемпературного стресса экзополисахарид. В речной воде с резкими колебаниями температуры в присутствии антагонистических факторов циркуляция токсигенных холерных вибрионов еще более ограничена. В эндемичных очагах холеры при высокой температуре речной воды персистенция токсигенных вариантов может быть достаточно длительной.
Непатогенные и условно эпидемически значимые вибрионы выживают в речной воде и сохраняют биопленки достаточно продолжительное время, что свидетельствует о выраженном персистентном потенциале.
Рецензенты:
Терентьев А.Н., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории диагностики ООИ. ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону;
Павлович Н.В., д.м.н., старший научный сотрудник, заведующая лаборатории туляремии ФКУЗ Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону.
Библиографическая ссылка
Сизова Ю.В., Черепахина И.Я., Бурлакова О.С. РОЛЬ ТЕМПЕРАТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ В ПЕРСИСТЕНЦИИ И БИОПЛЕНКООБРАЗОВАНИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ РАЗЛИЧНОЙ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22554 (дата обращения: 25.04.2024).