Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Непомнящая Е.М. 1 Кит О.И. 1 Нистратова О.В. 1 Новикова И.А. 1 Никипелова Е.А. 1 Бахтин А.В. 1 Ульянова Е.П. 1 Вострикова Ж.И. 1 Селютина О.Н. 1

---

1 ФГБУ «Ростовский Научно-Исследовательский Онкологический Институт» МЗ РФ

Изучено содержание циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в периферической крови 40 больных колоректальным раком. У исследованных больных был обнаружен повышенный уровень циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) >3 клеток (от 3 до 400 клеток в образце) в 75 % случаев. Все опухоли по своей гистоструктуре были аденокарциномами, различной степени диффернцировки (высокая, умеренная, низкая). Определено соотношение между содержанием ЦОК и некоторыми морфо-иммуногистохимическими показателями (пролиферативной активностью Ki-67, фактором апоптоза р53, ангиогенеза CD31 и адгезии ММП-2). Морфологические изменения в опухоли были сопоставимы с клиническими проявлениями в виде возникновения ранних рецидивов и метастазов в сроки до 24 месяцев. Полученные результаты исследования важны для понимания механизмов прогрессии рака толстой кишки и являются прогностическими.

Статья в формате PDF

345 KB

колоректальный рак

циркулирующие опухолевые клетки

морфо-иммуногистохимические показатели.

1. Архипова О. Е., Черногубова Е. А., Лихтанская Н. В., Тарасов В. А., Кит О. И., Матишов Д. Г. Анализ встречаемости онкологических заболеваний в Ростовской области. Пространственно-временная статистика // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 7-3. – С. 504-510.

2. Архипова О. Е., Черногубова Е. А., Тарасов В. А., Лихтанская Н. В., Кит О. И., Еремеева А. А., Матишов Д. Г. Уровень онкологических заболеваний как индикатор медико-экологической безопасности территории (на примере Ростовской области) // Вестник Южного научного центра РАН. – 2013. – Т. 9. – № 3. – С.7-14.

3. Зенюкова Т. В., Перевощиков А. Г., Кузьмичев Д. В., Барсуков Ю. А. Ядерный пролиферативный антиген и степень лечебного патоморфоза в клетках аденокарциномы анального канала после комплексного лечения // Российский онкологический журнал. – 2015. – № 5. – С.42-46.

4. Кит О. И. Проблема колоректального рака XXI века: достижения и перспективы // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. – 2013. – Т. 23. – № 3. – С.65-71.

5. Кит О. И., Новикова И. А., Бахтин А. В., Никипелова Е. А., Шатова Ю. С., Габараева В. М., Нистратова О. В. Первый опыт детекции циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови // Международный журнал экспериментального образования. – 2013. – № 11. – С. 37-39.

6. Колесник А. П. Прогностическое значение экспрессии р53 у больных с ранними стадиями немелкоклеточного рака легкого // Онкология. – 2013. – Т. 15. – № 1. – С.20-23.

7. Нефедова Н. А., Мальков П. Г. Роль стволовых клеток в канцерогенезе толстой кишки // Онкологическая колопроктология. – 2015. – 3. – Т. 5. – С.15-24.

8. Петров С. В., Райхлин Н. Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. – Казань, 2012. – С. 84,409.

9. Старостина М. А., Афанасьева З. А., Зинкевич О. Д., Сафина Н. А. Металлопротеиназы ММП-9 и их тканевые ингибиторы TIMP-1 в копрофильтратах у больных раком толстой кишки // Российский онкологический журнал. – 2011. – № 6. – С.38-39.

10. Хомяков Е. А. Динамическое наблюдение больных колоректальным раком после радикальных операций // Колопроктология. – 2015. – № 2(52). – С.57-67.

11. Roy Beveridge. Circulating tumor cell in management of metastatic breast cancer patients // Community onkology. – 2007. – № 2. – pр.79-82.

Колоректальный рак занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и смертности [1,2,4]. Только в России ежегодно регистрируется до 60000 новых случаев в год. У 30–50 % больных со II и III стадией заболевания после радикальных операций в течение первых пяти лет возникают рецидивы и/или метастазы [1,2,4]. В связи с этим актуальным остается вопрос прогнозирования развития последних. Опухолевую прогрессию определяют несколько механизмов: пролиферативная активность, факторы апоптоза, ангиогенеза. Они отвечают за рост и развитие опухоли, способности к инвазии и метастазированию. Одним из ведущих факторов в ангиогенезе являются матриксные металлопротеиназы (ММП). ММП относятся к семейству цинковых металлопротеиназ, функция которых связана с обменом белков межклеточного матрикса [9]. Им принадлежат функции активации, инактивации и модификации большого количества молекул, которые контролируют процессы инвазии, метастазирования и ангиогенеза [9].

Повышенная экспрессия ММП наблюдается практически во всех злокачественных опухолях и ассоциируется с агрессивным течением заболевания и неблагоприятным прогнозом. ММП с определенной избирательностью гидролизуют все основные компоненты соединительнотканного матрикса (СТМ). Тканевые коллагеназы: ММП-1, ММП-8, ММП-13 – гидролизуют фибриллярные коллагеназы – основу соединительнотканного матрикса, обеспечивая развитие процесса инвазии. Активность ММП в клетке реализуется различными механизмами: транскрипцией, активацией белка и взаимодействием с тканевыми ингибиторами матриксных металлопротеиназ (ТИММП).ММП-2 и ММП-9 – гидролизуют коллаген IV типа – основу базальных мембран, которая обеспечивает отделение эндотелиальных клеток от мембран с последующей их миграцией и участием в процессе ангиогенеза. ММП-2 и ММП-9 высвобождают ряд ангиогенных факторов, связанных с соединительнотканным матриксом [8,9]. Показано, что у больных с аденокарциномой легкого, выявлен значительный уровень экспрессии ММП-2 и ММП-9 опухолевыми клетками, что обусловливает высокую инвазивность опухоли, аналогичные данные получены и при раковых опухолях желудка [4,8].

Степень васкуляризации опухоли является мощным фактором, способствующим приобретению опухолью метастатического потенциала как на ранних, так и на поздних стадиях. При метастазировании гематогенным путем опухолевые клетки должны прикрепиться к эндотелию, выйти в просвет сосуда, выжить в циркулирующей крови, остановиться в какой-либо отдаленной ткани и образовать там клон [5].

Другим, не менее важным, маркером потенциала опухоли является белок р53. Р53 выполняет три основные функции: регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза (в случаях, когда повреждения ДНК клетки не могут быть репарированы), стабилизацию генома. Нарушение регуляции клеточного цикла, связанное с изменением активности р53, ведет к развитию и прогрессированию злокачественного процесса. Мутации гена p53 ведут к «сверхэкспрессии» этого белка, которые иммуногистохимическим путем выявляются с помощью анти-р53 антител. Считается, что иммуногистохимическая положительная реакция полностью зависит от наличия мутантного типа р53 [6].

Прогнозировать течение опухолевого процесса возможно, с использованием одного из маркеров пролиферативной активности ki-67. Во многих крупных исследованиях по течению опухолей различных локализаций показано, что ki-67 является универсальным фактором прогноза рецедивирования и общей безрецидивной выживаемости [3].

Не менее важным показателем развития опухолевой прогрессии является микрососудистая инвазия опухоли, которую иммуногистохимически можно выявить с помощью антител к CD31. По уровню экспрессии CD 31 производится подсчет плотности микрососудов в опухоли, которая является важным прогностическим признаком [8].

Еще одним из маркеров прогрессирования опухолевого процесса являются циркулирующие в крови опухолевые клетки, увеличение количества которых может стать поводом к более тщательному обследованию пациентов в «досимптомном периоде» [5,8,10]. В проведенных многоцентровых рандомизированных исследованиях показана роль повышения уровня ЦОК в развитии опухолевой прогрессии при раке молочной железы, предстательной железы и колоректальном раке. В ряде стран Запада данный параметр используется для коррекции химиотерапии (отмена, смена линии и т.д.) [11].

Цель исследования: изучить экспрессию некоторых иммуногистохимических маркеров (ki-67, р53, CD31,ММП-2) в зависимости от количества циркулирующих опухолевых клеток у больных с раковыми опухолями толстой кишки.

Материалы и методы исследования: в исследование были включены 40 больных (20 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 50 до 72 лет с IIIB стадией колоректального рака. Материалом для исследования служили удаленные опухоли толстого кишечника (после радикальной операции) и венозная кровь из периферической вены (в дооперационном периоде). Изучали количество циркулирующих опухолевых клеток в венозной крови с использованием системы CellSearch™, состоящей из двух приборов: станции пробоподготовки и анализатора. Принцип работы станции основан на подсчёте количества эпителиальных опухолевых клеток, выделяемых из крови. Идентификация клеток осуществляется с помощью флюоресцентно меченых антител к цитокератинам (СК8,СК18,СК19), общелейкоцитарному антигену CD45 и ядерного красителя DAPI. Анализ основан на иммуномагнитном обогащении клеток при помощи металлических наночастиц, покрытых полимерным слоем, содержащим антитела к EpCAM молекулам (маркеры эпителиальных клеток) с дальнейшей иммунофлуоресцентной идентификацией собранных в магнитном поле клеток. Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования, с помощью моноклональных антител ki-67, р53, CD31,ММП-2 фирмы Dako. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-LinkThermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65 °C , восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97 °C и дальнейшее охлаждение до 65 °C . Затем стекла промывали в течение 1–3 минут TBS-буфером (Dako) и помещали в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции RevealPolyvalent HRP-DAB DetectionSystem. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку экспрессии маркеров изучали как минимум на 10 случайно выбранных полях зрения с применением светового микроскопа ZeissAxioImager M2 под увеличением х10, х40.

В исследовании применяли следующие критерии оценки маркеров:

1) опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли отсутствовала ядерная реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 25 %, и положительной по р53, если было окрашено более 25 % ядер опухолевых клеток;

2) для оценки пролиферативной активности (ПА) опухоли подсчитывали количество ki-67-положительных опухолевых клеток, приходящихся на 200–300 опухолевых клеток. Индекс ki-67 определяли по формуле:

ПА= число ki-67 положительных клеток х 100/общее количество клеток.

Маркеры пролиферативной активности расценивали на основе наиболее часто употребляющегося способа оценки пролиферативной активности: 0 % – 20 % – низкая пролиферативная активность, 21 % – 50 % – умеренная пролиферативная активность, 51 % –100 % – высокая пролиферативная активность;

3) Для оценки ангиогенеза в опухолях использовали индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumormicrovesseldensity – MVD). Микрососуды окрашивали антителом CD31. Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата при использовании объектива х40 с использованием программы AxioVs40 v-4.8.1.0.

Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoftInc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0).

Результаты исследования и их обсуждение: у исследованных больных был обнаружен повышенный уровень ЦОК>3 клеток (от 3 до 400 клеток в образце) в 75 % случаев. По стандартам, применяемым к исследованию ЦОК, образец считается положительным, при любом количестве ЦОК большем, чем 3 клетки. При этом у большего числа пациентов (42,5 %) с высоким уровнем ЦОК при морфологическом исследовании операционного материала была диагностирована низкодифференцированная аденокарцинома. Соотношение количества ЦОК со степенью дифференцировки опухоли показана в таблице 1.

Таблица 1

Зависимость количества ЦОК в периферической крови от степени дифференцировки опухоли

Примечание: * – статистически значимое различие выявления у больных с ЦОК > 3 и < 3с низкодифференцированной аденокарциномой, р=0,0235.

Ретроспективный анализ показал, что ранние рецидивы и метастазы (в сроки до 24 месяцев) развивались чаще у больных с уровнем ЦОК > 3 клеток.

У 67,5 % от общего числа больных была выраженная экспрессия ММП-2. Высокая и умеренная пролиферативная активность была отмечена в 100 % случаев. Экспрессии р53 была отмечена в 67,5 % случаев. CD31 экспрессировался в 75 % образцов, что отражает выраженную микрососудистую инвазию (см. рис. 1–4). Полученные данные иммуногистохимического исследования отражены в таблице 2 и сопоставимы с уровнем ЦОК.

Таблица 2

Показатели ЦОК и иммуногистохимических маркеров

Примечание: статистически значимые различия при ЦОК <3и > 3 выявлены: * и ** – по экспрессии р53, р=0,0383; ° и °° – по экспрессии CD31, р=0,00001;ʹ и ʹ ʹ – по экспрессии ММП-2, р=0,0001.

Из таблицы 2 видно, что у больных с высоким уровнем ЦОК отмечена положительная экспрессия маркеров апоптоза, а также маркеров, отражающих микрососудистую инвазию и метастатический потенциал опухоли.

Рис.1. Высокая пролиферативная активность (ki-67) в раковых клетках. ИГХ-исследование

Рис. 2. Содержание р53 в раковых клетках толстой кишки. ИГХ-исследование

Рис. 3. Экспрессия CD31. Микрососудистая плотность при колоректальном раке.

ИГХ-исследование

Рис. 4. Положительная реакция ММП-2 в раковых клетках толстой кишки.

ИГХ-исследование

Заключение: проведенное исследование показало, что количество ЦОК находится в прямой зависимости от маркеров апоптоза (р53) (р=0,0383), микрососудистой инвазии (CD31) (р=0,00001), ММП-2 (р=0,0001). Данные морфологические изменения были сопоставимы с клиническими проявлениями в виде возникновения ранних рецидивов и метастазов (у больных с повышенным количеством ЦОК, метастазы и рецидивы возникали в более ранние сроки). Полученные результаты важны для понимания механизмов прогрессии рака толстой кишки и являются прогностическими.

Библиографическая ссылка