Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,682

КОГНИТИВНЫЕ НАРУШЕНИЯ У КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ В ГИППОКАМПЕ С ПОМОЩЬЮ НЕЙРОТОКСИКАНТА ХЛОРИДА ТРИМЕТИЛОЛОВА

Першина Е.В. 1, 2 Архипов В.И. 1, 2
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
2 Пущинский государственный естественно-научный институт
Водорастворимый нейротоксикант хлорид триметилолова (ТМТ) вызывает у млекопитающих значительные повреждения мозга, преимущественно в гиппокампе, что сопровождается расстройством различных форм поведения, а также провоцирует судорожную активность. В работе изучали влияние однократной инъекции хлорида триметилолова (ТМТ) в дозе 7,5 мг/кг на обучение крыс в лабиринте с четырьмя целевыми полками. Для предотвращения возникновения судорог через 24 и 48 часов после ТМТ крысам дважды вводили пентобарбитал (25 мг/кг, в/б). Выработку реакции чередования у крыс начинали через одну неделю после инъекции ТМТ. Результаты показали, что обучение животных опытной и контрольной групп не различались. Однако после изменения экспериментальных условий, когда одна из подкрепляемых полок была заменена на другую, поведение крыс опытной группы заметно отличалось от контроля: они с трудом подавляли реакцию к неподкрепляемой полке, совершая больше ошибок. Снижение способности животных к переучиванию и дефекты ориентировочного рефлекса подтверждают преимущественное повреждение гиппокампа после однократного системного введения ТМТ.
обучение и память
гиппокамп
нейротоксичность
хлорид триметилолова
1. Arkhipov V., Kulesskaja N., Lebedev D. Behavioral perseveration and impairment of long-term memory in rats after intrahippocampal injection of kainic acid in subconvulsive dose // Pharmacol. Biochem. Behav. 2008. Vol. 88. № 3. – P. 299-305.
2. Corvino V., Marchese E., Michetti F. et al. Neuroprotective strategies in hippocampal neurodegeneration induced by the neurotoxicant trimethyltin // Neurochem Res. 2013.Vol. 38. № 2. – P. 240-53.
3. Earley B., Burke M., Leonard B.E. Behavioural, biochemical and histological effects of trimethyltin (TMT) induced brain damage in the rat // Neurochem. Int. 1992. Vol. 21. № 3. – P. 351-66.
4. Geloso M.C., Corvino V., Michetti F. et al. Trimethyltin-induced hippocampal degeneration as a tool to investigate neurodegenerative processes // Neurochem Int. 2011. Vol. 58. № 7. – P. 729-38.
5. Langston R.F., Stevenson C.H., Wilson C.L. et al. The role of hippocampal subregions in memory for stimulus associations // Behav Brain Res. 2010. vol. 215. № 2. – P. 275-291.
6. Salz D.M., Tiganj Z., Khasnabish S. et al.Time Cells in Hippocampal Area CA3 // The Journal of Neuroscience. 2016. Vol. 36. № 28. – P. 7476-7484.
7. Trabucco A., Di Pietro P., Nori S. L. et al. Methylated tin toxicity a reappraisal using rodents models // Archives italiennes de biologie. 2009. Vol. 147. № 4. – P. 141-153.
8. Tsutsumi S., Akaike M., Arimitsu H. et al. Circulating corticosterone alters the rate of neuropathological and behavioral changes induced by trimethyltin in rats // Exp. Neurol. 2002. Vol. 173. – P.86-94.
9. Vinogradova O.S. Hippocampus as comparator: role of the two input and two output systems of the hippocampus in selection and registration of information // Hippocampus. 2001. Vol. 11. № 5. – P. 578-598.

Хлорид триметилолова (TMT) является нейротоксикантом, применяющимся в производстве и сельском хозяйстве [7]. Экспериментальные исследования на животных, предпринятые с целью выяснения механизмов действия ТМТ, показали, что вещество вызывает ряд патологических явлений в центральной нервной системе: расширение боковых желудочков, отек мозга, нейродегенерацию [3, 4]. Способность ТМТ вызывать нейрональную гибель в отдельных областях мозга дает возможность использовать этот нейротоксикант в качестве экспериментальной модели, позволяющей изучать клеточно-молекулярные механизмы нейродегенерации, намечать подходы для создания новых нейропротективных средств [2]. Использование TMT в качестве инструмента нейродегенерации дает несколько преимуществ: 1) известны повреждаемые области мозга, клеточные мишени и динамика нейродегенерации; 2) гематоэнцефалический барьер не претерпевает существенных изменений, что ограничивает вклад периферических факторов в механизмы нейротоксичности; 3) известные белковые и мРНК-маркеры могут быть использованы в качестве положительного контроля при изучении экспрессии генов, связанной с действием TMT. Первичной мишенью действия ТМТ на нейроны являются, по-видимому, митохондрии, в частности, локализованный на внешней мембране высоко консервативный мембранно-связанный белок станнин (stannin). Как при действии и других нейротоксинов, наблюдается активация циклооксигеназ, провоспалительных цитокинов, индукторов апоптоза, нарушение кальциевого обмена, что свидетельствует о развитии окислительного стресса, эксайтотоксичности, нейровоспаления [2, 4].

Важная особенность действия ТМТ заключается в спонтанном восстановлении и нормализации некоторых функций мозга, например, показано, что возникающая  судорожная активность у крыс исчезает через 2–3 недели после инъекции нейротоксиканта [4]. Рассматривая характер поведенческих нарушений, вызванных ТМТ у крыс, можно отметить их существенное многообразие – от изменения двигательных реакций до специфических когнитивных дисфункций. Особенности дефектов обучения и памяти, которые выявлены в различных поведенческих тестах, определяются своеобразием нарушений, вызванных ТМТ в структурах мозга животных. У мышей и крыс TMT вызывает гиперактивность в открытом поле, повышение двигательной активности и нарушение обучения в тестах пассивного и активного избегания, поведения в Т-образном лабиринте и водном лабиринте Морриса [3, 4]. Гиппокампальные нарушения поведения у животных были показаны и через длительные промежутки времени: даже через 16 недель после введения ТМТ было выявлено ухудшение обучения крыс в лабиринте Морриса [8]. Эффекты, вызываемые ТМТ, как и любого фармакологического агента, зависят от дозы, способа введения вещества, а также от типа поведенческого теста и промежутка времени между инъекцией и тестированием. В экспериментальных работах, посвященных изучению когнитивных функций, основное внимание уделяется реакциям, зависящим от гиппокампальной системы, однако, полученные результаты могут интерпретироваться по-разному. В настоящей работе изучали влияние однократной инъекции ТМТ на обучение крыс в лабиринте. Для того чтобы исключить влияние судорожной активности на развитие нейродегенеративных процессов и для облегчения проведения поведенческих экспериментов, после инъекции ТМТ животным вводили противоэпилептический препарат (пентобарбитал).

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар (n=28) весом 210-220 г.  Животных содержали и использовали в соответствии с правилами Совета Европейского сообщества (директива от 1986 г.).

Введение ТМТ. После предварительного привыкания к рукам крысам делали однократную инъекцию ТМТ (Sigma) в дозе 7,5 мг/кг, подкожно. Вещество растворяли в изотоническом растворе NaCl и вводили в объеме 0,5 мл. Контрольным животным делали инъекции изотонического раствора NaCl в том же объеме. После этого животных отсаживали в клетки и ежедневно взвешивали; воду и корм этим животным давали без ограничений. Другой группе животных вводили ТМТ (7,5 мг/кг) и через одну неделю начинали обучение в лабиринте с пищевым подкреплением.

Поведенческие эксперименты. Обучение крыс навыку чередования с пищевым подкреплением в лабиринте с четырьмя целевыми полками (Рис. 1) начинали через 7 дней после инъекции ТМТ. Предварительное привыкание к экспериментальной обстановке в течение двух дней заключалось в помещении каждого животного на 10–15 минут в лабиринт, в котором были разложены смоченные шарики хлеба. Выработку навыка проводили в течение шести дней до достижения животными критерия: среднее время побежки за дневную серию должно составлять менее 10 секунд. В день животные совершали по 10 побежек. В этот период обучения крысы получали подкрепление на полках № 1 и № 2. После обучения в течение 6 дней изменяли экспериментальные условия: пищевое подкрепление осуществляли на полках № 1 и № 4. При этом регистрировали время побежек и число ошибочных реакций к неподкрепляемой полке № 2.

 

Рис. 1. Схема лабиринта. Цифрами указаны номера полок для пищевого подкрепления

 

Результаты и обсуждение

Одно из заметных проявлений токсического действия ТМТ на крыс заключается в нарушении пищевого поведения и, как следствие, потере массы тела. Действительно, в течение первых двух дней после инъекции ТМТ вес животных снизился и оставался примерно постоянным в течение одной недели. Затем вес животных стал увеличиваться, и через три недели после инъекции крысы контрольной и опытной групп по этому показателю достоверно не различались (Рис. 2).

 

Рис.2. Среднее значение привеса животных. Изменение массы тела крыс после инъекции хлорида триметилолова в дозе 7,5 мг/кг в контрольной (n=6) и опытной (n=6) группах

 

Выработку навыка чередования в лабиринте у животных опытной и контрольной групп начинали, когда пищевая мотивация, нарушенная ТМТ, нормализовалась – через одну неделю после инъекции нейротоксиканта и изотонического раствора NaCl. Стабильное воспроизведение навыка наблюдалось через 4–5 дней обучения. Результаты показали, что динамика обучения животных контрольной и опытной групп была сходной, и время побежек достоверно не различалось между группами (Рис. 3).

 

Рис. 3. Динамика выработки реакции чередования с пищевым подкреплением в лабиринте у крыс (n=16). A – усредненное значение времени побежек за день. Динамика обучения через одну неделю после однократной инъекции хлорида триметилолова в дозе 7,5 мг/кг. Б – среднее время побежек после изменения подкрепляемых полок (№1-2 на №1-4)

 

В наших экспериментах применение ТМТ не оказало существенного влияния, как на двигательную активность животных, так и на способность к выработке реакции чередования. Однако изменение подкрепления выявило дефекты в поведении опытных крыс: у них существенно ухудшилась способность адекватно реагировать на изменившуюся экспериментальную ситуацию. Целевая полка № 2 на этой стадии эксперимента уже не подкреплялась, однако крысы продолжали совершать к ней побежки; причем число таких реакций, которые рассматривались как ошибочные, было больше у животных опытной группы, чем контрольной (Рис. 4). Настойчивое повторение заученной реакции, потерявшей биологическое значение, характерно для животных с поврежденным гиппокампом, например, в ситуации экспериментального угашения навыка (вызванное отсутствием подкрепления) [1].

 

Рис. 4. Среднее число ошибочных побежек к неподкрепляемой полке № 2, совершаемых крысами через 2 недели после инъекции хлорида триметилолова и контрольными животным. Указано значение М±s; * - P<0,02, по критерию Манна – Уитни

 

            Гиппокамп чувствителен ко многим повреждающим воздействиям,  и его дефекты проявляются при проведении различных поведенческих тестов. Результаты исследований последних лет показывают, что нейроны гиппокампа способны кодировать не только пространственные, но и временные параметры, принимая участие в когнитивных функциях, связанных с регистрацией и воспроизведением информации [6]. Особое значение для обучения имеет участие гиппокампа в механизмах ориентировочно-исследовательского поведения, так как формирование осознаваемой (декларативной, эпизодической) формы памяти невозможно без проявления ориентировочной реакции. Животные с поврежденным гиппокампом показывают повышенную реактивность к новым раздражителям и сниженную продолжительность сна. Однако некоторые формы поведения не меняются, например, такие как груминг, потребление пищи и воды. Животные с дефектным гиппокампом менее любопытны, у них нет необходимости в увеличении притока информации, поэтому нарушены свойства ориентировочного рефлекса: его избирательность, возможность переключения с одного стимула на другой; тормозящее влияние на другие виды деятельности [9]. Триметилолово в дозе, используемой в настоящей работе, вызвал ограниченное повреждение гиппокампа, которое проявилось через четыре недели после инъекции как снижение способности к переучиванию, не повлияв на общую двигательную активность и выработку реакции чередования в лабиринте. Гибель нейронов, как это следует из литературных и наших предварительных данных, ограничивается полями СА3-СА4 и зубчатой фасцией. Кроме того, следует принять во внимание фармакологическое подавление судорожной активности, предпринятое нами в этой работе, что также ограничивает повреждающее влияние ТМТ на гиппокамп. Специфический характер нейротоксического повреждения, когда гибель нейронов ограничена отдельными полями, позволяет оценить их возможную роль в когнитивных функциях. Действительно, хорошо известно, что эффекты повреждения гиппокампа зависят не только от того, каков объем повреждений, но и от субрегионального распределения гибели нейронов. Общепринятым можно считать сам факт особого вклада в механизмы когнитивных функций субрегионов гиппокампа, но мнения относительно того, какие именно функции они выполняют, противоречивы, на что указывают, например, авторы обзора [5]. После рассмотрения большого массива экспериментальных результатов в обзоре делается вывод, что поле СА1 специфически вовлекается, когда требуется процессинг событий во времени. Это проявляется двумя путями: во-первых, при образовании ассоциативных связей во времени (например, когда применяется отсрочка между стимулами); во-вторых, при запоминании порядка стимулов во времени. Поле СА3 требуется как для постепенного, так и для быстрого формирования ассоциативных связей между событием и пространственной информацией (контекстом). Разрушение дорсального поля СА3 не нарушает постепенное приобретение пространственной информации, однако поле СА3, по-видимому, необходимо для быстрого кодирования новой пространственной информации. О функциональных особенностях зубчатой фасции известно меньше – отмечается, что в этом субрегионе гиппокампа происходит предварительная обработка информации, которая передается в СА3, где она связывается с другими стимулами [5]. Такое заключение согласуется с представлением о компараторной роли поля СА3, которое было обосновано О.С. Виноградовой [9].

Заключение

Экспериментальная модель нейрональной гибели, вызванной ТМТ, представляет большой интерес при исследовании механизмов нейродегенерации, прежде всего, в гиппокампе. Нейродегенеративные процессы, происходящие как в нормальных условиях при развитии и старении, так и при многих заболеваниях (эпилепсия, болезни Паркинсона и Альцгеймера и др.), сопровождаются нарушением когнитивных функций. Специфичность таких нарушений может указывать на возникновение и развитие нейродегенеративного процесса. Морфо-функциональные нарушения гиппокампа, вызванные ТМТ, со временем частично компенсируются. Очевидно, что нарушение клеточного состава в полях СА3-СА4 гиппокампа необратимо, вследствие чего такие компенсаторные процессы должны происходить благодаря модификации нейрональных сетей, с участием экстрагиппокампальных структур. Таким образом, благодаря особенностям действия ТМТ на мозг, эту экспериментальную модель можно рассматривать как вполне адекватную для разработки новых средств терапии нейродегенеративных заболеваний.

 

Работа поддержана РФФИ-мол_а № 16-34-01167.


Библиографическая ссылка

Першина Е.В., Архипов В.И. КОГНИТИВНЫЕ НАРУШЕНИЯ У КРЫС ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАЦИИ В ГИППОКАМПЕ С ПОМОЩЬЮ НЕЙРОТОКСИКАНТА ХЛОРИДА ТРИМЕТИЛОЛОВА // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 4.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25020 (дата обращения: 22.06.2018).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252