Белок VEGFR-2 (другие названия – Flk-1, KDR) является основным рецептором, опосредующим передачу сигнала от лиганда VEGF как в эндотелиальных клетках, так и в клетках других типов. Функционирование рецептора VEGFR-2 на протяжении эмбриогенеза является критическим для развития организмов. Нокаут гена Flk1, кодирующего белок-рецептор VEGFR-2, приводит к гибели эмбрионов мышей в период между 8,5–9,5 днями. Причиной гибели эмбрионов является образование в зародыше недостаточного количества гемопоэтических и эндотелиальных клеток-предшественников. Более того, у эмбрионов с выключенной экспрессией гена Flk-1 вплоть до момента гибели не наблюдаются нормально сформировавшиеся кровеносные сосуды [15, 18].
Длительное время считалось, что VEGF, являющийся сильным митогеном, влияет преимущественно на инициацию ангиогенеза/васкулогенеза. Однако в последнее время получила развитие концепция о критической роли сигналинга через рецептор VEGFR-2 для широкого спектра физиологических и патологических процессов, включая канцерогенез, сердечно-сосудистую патологию, офтальмологические проблемы [4]. Образование комплекса VEGFR/VEGFR-2 необходимо для активации основных звеньев морфогенеза сосудов – стимуляции пролиферации и миграции эндотелиальных клеток [2]. В разных тканях и разных видах опухолей регистрируется различный уровень экспрессии VEGFR-1 и VEGFR-2, что открывает новые возможности для таргетной терапии [22].
Детальные исследования роли рецептора VEGFR-2 в эмбриональном развитии проводились с помощью химерных эмбрионов, у которых присутствовали эмбриональные стволовые клетки с генотипом Flk1-/-. Показано, что проведение сигналов через VEGFR-2 необходимо для миграции гемангиобластов из области примитивной полоски в желточный мешок, где они формируют островки кроветворения [16]. В экспериментах с эмбриональными стволовыми клетками с генотипом Flk1-/- установлено, что их дифференцировка in vitro в гемопоэтические и эндотелиальные клетки существенно замедлена по сравнению с интактными стволовыми клетками [15]. На более поздних стадиях эмбриогенеза доказано участие VEGFR-2 в формировании предсердно-желудочковых клапанов [23]. Проведение сигнала через рецептор необходимо для превращения эндокардиальных валиков, расположенных в предсердно-желудочковом канале, в зрелые удлиненные пластинки сердечного клапана.
Параллельно с изучением роли VEGFR-2 в эмбриональном развитии проводились исследования по выяснению роли этого рецептора в дифференцировке клеток и гистогенезе. В конце 1990-х – начале 2000-х гг. был разработан метод, позволявший вызывать экспрессию рецептора VEGFR-2 на поверхности недифференцированных стволовых клеток. Из таких эмбриональных стволовых клеток в особых условиях культивирования образовывались Flk-1+-клетки (т.е. несущие на своих мембранах рецептор VEGFR-2), способные к дифференцировке в перициты и эндотелиоциты. После преобразования эмбриональных стволовых клеток в Flk-1+-клетки стало возможным также получение из одной такой клетки популяции кардиомиоцитов [26, 27]. Эти результаты неоднократно подтверждались другими исследователями, проводившими опыты со стволовыми клетками, которые были получены из различных источников. Так, при сравнении дифференцировочных потенциалов мультипотентных стволовых клеток зародышевой линии, эмбриональных стволовых и эмбриональных половых клеток в возможностях их направленной дифференцировки в кардиомиоциты и эндотелиальные клетки через 4 дня после индукции дифференцировки in vitro у 30–40% клеток каждого исследуемого типа на мембранах обнаруживались рецепторы VEGFR-2 [3]. В дальнейшем в клетках с VEGFR-2 отмечались признаки дифференцировки в кардиомиоциты и эндотелиальные клетки.
В настоящее время VEGFR-2 (Flk-1) наряду с другими транскрипционными факторами, такими как Isl-1 и Nkx2.5, относят к ранним маркерам кардиомиогенеза [7] или к ранним мезодермальным маркерам [13]. Показано, что субпопуляция прогениторных клеток с фенотипом CXCR4(+)/Flk-1(+) в отличие от CXCR4(-)/Flk-1(-) активно экспрессирует такие транскрипционные факторы кардиомиогенной дифференцировки, как Mef2C, Myocardin, Nkx2.5. На этом основании авторы полагают, что наличие такой пары биомаркеров, как CXCR4/Flk-1, в плюрипотентных стволовых клетках свидетельствует об их вероятной дифференцировке в направлении кардиомиоцитов [13].
Сигнал, проходящий через VEGFR-2, влияет на многие стороны жизнедеятельности клетки, его дальнейшее распространение происходит сразу по нескольким независимым путям. Особый интерес представляет реализация цитопротекторной функции VEGF, которая осуществляется через внутриклеточный сигнальный путь Flk-1/PI3K/Akt, участвующий в регуляции роста, дифференцировки и выживания клеток [20]. Показано, что для многих клеточных типов активация Akt-сигналинга является достаточным условием для блокирования апоптоза благодаря взаимодействию этой киназы с белками семейства Bad, транскрипционными факторами семейства FKHR и IKKα [19]. Кроме того, Akt способствует поступлению глюкозы в клетку, индуцируя мембранную транслокацию транспортного белка GLUT4, и усиливает синтез гликогена, взаимодействуя с гликогенсинтазой GSK-3, т.е. участвует в обеспечении внутриклеточного энергетического гомеостаза [29]. Наконец, Akt регулирует клеточный цикл и старение клеток через модулирование активности таких факторов, как E2F, p21, MDM2 и обратная транскриптаза теломеразы человека (hTERT) [19].
Добавление некоторых сигнальных молекул (в частности, активина А) к культуре эмбриональных клеток, которые культивируются совместно со стромальными клетками, стимулирует развитие клеток с фенотипами Flk-1(+)/PDGFRα(+) (ранние мезодермальные клетки) и Flk-1(+)/PDGFRα(-) (клетки боковой мезодермы) [8]. Flk-1(+)-мезодермальные клетки в дальнейшем дифференцируются в CD41(+) эндотелиальные клетки, которые обладают преимущественно гемопоэтическим потенциалом. Более того, именно Flk-1(+)/PDGFRα(+)-клетки (но не Flk-1(+)/PDGFRα(-)-клетки) генерируют гемопоэтические с бимодальными характеристиками. Некоторые из клеток-предшественников, коэкспрессирующих эти маркеры, могут селективно вовлекаться в кардиогенез, а выделение клеток, произошедших от эмбриональных клеток с такими маркерами, будет способствовать более эффективному кардиомиогенезу при клеточной терапии.
Трансплантация Flk-1-положительных мультипотентных стволовых клеток зародышевой линии в поврежденный миокард мышей (инъекции в пограничную область между нормальной и зарубцевавшейся тканью), у которых была вызвана ишемическая сердечная недостаточность, через 4 недели обусловливала выраженное увеличение толщины стенки левого желудочка в области инфаркта, повышение фракции выброса и максимальной систолической скорости миокарда левого желудочка [10]. Несмотря на то что число кардиомиоцитов, произошедших из Flk-1-положительных клеток, оказалось недостаточным для существенных изменений функции сердца, у животных с трансплантированными клетками наблюдался более интенсивный ангиогенез вокруг зон ишемии по сравнению с таковым у контрольных животных.
При исследовании Flk-1-положительных клеток, которые получали из плюрипотентных стволовых клеток человека и эмбрионов мыши, установлено, что на поверхности некоторых из них присутствует рецептор к вирусу Коксаки и аденовирусу (coxsackievirus and adenovirus receptor – CAR) [14]. Этот рецептор является белковой молекулой, отвечающей за межклеточные контакты. Выделены клеточные популяции с фенотипами Flk-1(+)CAR(-) и Flk-1(+)CAR(+), эффективно формирующие популяции гемопоэтических клеток и кардиомиоцитов соответственно. Следовательно, по результатам исследований был выявлен новый маркер, по которому можно отделять Flk1-положительные мезодермальные клетки, способные давать начало колониям кардиомиоцитов.
Результаты представленных работ свидетельствуют о важности оценки уровня экспрессии VEGFR-2 в клеточных культурах, которые подготавливают в качестве материала для трансплантата в пораженное сердце [21]. Наличие на поверхности клеток рецептора VEGFR-2 позволяет отбирать их с целью последующего воспроизводства популяции клеток — предшественников кардиомиоцитов.
Определение уровня экспрессии VEGFR-2 целесообразно не только в клеточных популяциях, проходящих трансдифференцировку в кардиомиоциты, но и в пораженном патологическим процессом миокарде, в который вводят стволовые клетки. При моделировании инфаркта миокарда у крыс путем перевязки передней левой нисходящей артерии с введением в пораженную ишемией зону клеток костного мозга через 1, 3, 7, 14 и 28 суток выявлена экспрессия VEGF и VEGFR-2 в очаге инфаркта и пограничной зоне [28].
С помощью метода иммунофлуоресцентной микроскопии показано, что экспрессия VEGF и VEGFR-2 возрастает в кардиомиоцитах, расположенных в зонах инфаркта и пограничной области. Методом ОТ-ПЦР установлено, что уровень экспрессии мРНК VEGF и VEGFR-2 выше в сердцах животных экспериментальной группы по сравнению с аналогичным показателем животных контрольной группы. Причем в экспериментальной группе экспрессия мРНК и белка VEGFR-2 с 1-го по 7-й день после трансплантации была выше, чем в контрольной группе. На 14-й день уровни экспрессии мРНК и белка VEGFR-2 в экспериментальной группе выросли по сравнению с предыдущими днями и тем более по сравнению с соответствующими показателями контрольной группы. На 28-й день после трансплантации в обеих группах наблюдалось снижение экспрессии мРНК и белка VEGFR-2. При этом на 7-й, 14-й и 28-й день у животных, перенесших трансплантацию, значения показателя dp/dt были достоверно выше, чем у контрольных. Эти данные свидетельствуют о том, что пересадка клеток способствует частичному восстановлению нормальной функции пораженного сердца. После 14-го дня в пересаженных клетках костного мозга начинали обнаруживаться специфические маркеры, характерные для кардиомиоцитов или эндотелия сосудов [28]. Результаты этого исследования ясно указывают на то, что по уровню экспрессии VEGFR-2 на поверхности кардиомиоцитов и клеток трансплантата можно судить об эффективности клеточной терапии.
В исследовании с использованием мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга мыши, геном которой был модифицирован геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок, культуры одних клеток выдерживали в условиях гипоксии (0,5% содержание кислорода) в течение 24 ч, другие – при нормальном содержании кислорода [9]. У подопытных крыс вызывался инфаркт миокарда, затем в область миокарда, пограничную с пораженным участком, вводили «экспериментальные» и «контрольные» популяции клеток. Состояние и размеры очага инфаркта, функцию сердца оценивали спустя 6 недель после трансплантации. Выдерживание клеток в условиях недостатка кислорода привело к повышению в них выработки VEGF, VEGFR-2 и ряда белков, отвечающих за усиление жизнеспособности клеток. В образцах ткани, куда пересаживались клетки из «экспериментальных» популяций, обнаруживались более интенсивный ангиогенез и лучшее заживление поврежденного участка миокарда по сравнению с образцами, в которые пересаживали клетки из «контрольных» популяций. Данные функциональных исследований свидетельствовали о том, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток предотвращала выраженные структурные изменения левого желудочка.
При оценке регенераторного потенциала мезенхимальных стволовых клеток и CD34-положительных клеток у крыс с экспериментальным инфарктом миокарда значимое уменьшение очагов инфаркта и амплитуды зубца Т на электрокардиограмме выявлено только при использовании CD34-положительных клеток [17]. В обеих группах крыс после клеточной терапии очаги инфаркта и кардиосклероза были меньше, чем у нелеченых особей. С помощью ОТ-ПЦР показано, что введение CD34-положительных клеток сопровождалось значительным повышением уровня экспрессии генов VEGF и VEGFR-2, а также генов, кодирующих ангиопоэтин-1 и белок-рецептор к нему. Эти показатели были ниже у крыс, которым вводили мезенхимальные стволовые клетки; еще более низкими эти показатели были у нелеченых животных с инфарктом миокарда [17]. Полученные данные указывают на то, что эффективность клеточной терапии ассоциирована с повышением экспрессии VEGFR-2 в миокарде реципиентов.
В экспериментах с использованием Flk-1-положительных и Flk-1-отрицательных клеток (селектированных при культивировании клеток из перикардиальной жировой ткани) у крыс с воспроизведенным инфарктом миокарда установлено, что трансплантация Flk1-положительных клеток приводила к более выраженной структурной регенерации миокарда по сравнению с трансплантацией Flk-1-отрицательных клеток или отсутствием клеточной терапии [12, 25]. Другими словами, Flk-1-положительные клетки обладают более выраженными потенциями в отношении кардиомиогенеза и восстановления пораженных участков миокарда, чем Flk-1-отрицательные клетки. Результаты этого и других исследований свидетельствуют о том, что перикард и его жировая ткань являются одними из депо Flk-1-положительных клеток и играют важную роль в регенерации ишемизированного миокарда [25].
Применение ресвератрола (полифенола), как показано при моделировании инфаркта миокарда у крыс, значительно усиливает экспрессию VEGF и его тирозинкиназного рецептора Flk-1 [6]. Предварительное использование ресвератрола сопровождается также увеличением продукции NO-синтазы (индуцибельной и эндотелиальной NOS) и антиапоптотического и проангиогенного факторов – ядерного фактора NF-κB и белка специфичности (SP)-1. На фоне этого происходит увеличение плотности капиллярной сети и улучшение функции левого желудочка.
Цитопротекторная роль сигналинга через Flk-1 была подтверждена в экспериментах с изолированными сердцами, полученными от мышей дикого типа (WT) и гетерозигот Flk-1(+/-) и подвергнутыми ишемическому воздействию в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 2 ч [24]. В миокарде мышей-гетерозигот с фенотипом Flk-1(+/-) на 50% была снижена экспрессия мРНК Flk-1 по сравнению с контрольными животными и замедлено восстановление функциональной активности левого желудочка через 2 ч реперфузии. Более того, у нокаутных мышей Flk-1(+/-) были увеличены размеры очага инфаркта (38,4% против 28,4% в контроле, p<0,05), регистрировалось большее количество апоптотических кардиомиоцитов (495 против 213). Установлено также, что цитопротекторный эффект прекондиционирования у нокаутных мышей был заметно снижен по сравнению с животными дикого типа.
Усиление экспрессии VEGFR-2 (KDR/Flk-1) в кардиомиоцитах выявлено и в других моделях повреждения миокарда, в частности при моделировании антрациклиновой кардиомиопатии [1]. По данным иммуногистохимического исследования развитие антрациклиновой кардиомиопатии сопровождается усилением экспрессии KDR/Flk-1 в кардиомиоцитах (индекс Flk-1-позитивных кардиомиоцитов возрастает в 7 раз по сравнению с контролем). Предполагается, что усиление экспрессии Flk-1 в кардиомиоцитах связано с активацией цитопротекторных реакций в ответ на повреждающее воздействие доксорубицина.
Следует особо отметить, что кардиотоксичность различных схем химио- и радиотерапии по-прежнему остается очень серьезной проблемой. В последнее время стало появляться большое количество новых лекарственных препаратов с так называемым таргетированным действием, которые представляют собой преимущественно моноклональные антитела и тирозинкиназные ингибиторы [5]. Цитотоксические свойства таких препаратов существенно отличаются от традиционных химиотерапевтических препаратов. Среди нового класса лекарственных веществ представлены ингибиторы лиганда VEGF и его рецептора VEGFR-2, терапевтическая эффективность которых проявляется в угнетении ангиогенеза («сосудистой токсичности»). Кардиотоксические эффекты таких препаратов проявляются в аритмиях, ишемических расстройствах (возможно, в инфарктах), гипертензии, тромбоэмболиях, дисфункции левого желудочка и развитии сердечной недостаточности [11]. Кроме того, как уже было упомянуто выше, VEGF и активируемый им сигнальный путь играют важную роль в поддержании кардиоваскулярного гомеостаза.
Таким образом, экспрессию VEGFR-2/Flk-1 в малодифференцированных клетках можно рассматривать в качестве одного из ранних маркеров их дифференцировки в направлении кардиомиоцитов или эндотелиоцитов. На основании этих данных многие исследователи полагают, что успех клеточной терапии при острых и хронических патологических процессах в сердце зависит от того, насколько активно экспрессируется VEGFR-2/Flk-1 в популяции недифференцированных клеток, подготовленных для трансплантации в поврежденный орган. Об успехе клеточной терапии можно также судить по динамике уровня экспрессии VEGFR-2/Flk-1 в миокарде реципиентов. Усиление экспрессии VEGFR-2/Flk-1 в кардиомиоцитах при ишемии/реперфузии миокарда и при других цитопатических воздействиях отражает усиление цитопротекторных реакций в кардиомиоцитах и может служить одним из маркеров для оценки жизнеспособности мышечных клеток сердца.
Библиографическая ссылка
Мешков И.О., Новоселова Е.И., Бушманова Г.М., Семенов Д.Е. РОЛЬ РЕЦЕПТОРА-2 VEGF (KDR/FLK-1) В КАРДИОМИОГЕНЕЗЕ И ЦИТОПРОТЕКТОРНЫХ РЕАКЦИЯХ // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 6. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=25917 (дата обращения: 17.04.2024).