Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И МОРФОЛОГИЮ ОЧАГА ПОВРЕЖДЕНИЯ В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ

Осиков М.В. 1 Гиниатуллин Р.У. 2 Кузьмин А.Н. 1
1 ФГБОУ ВО "Южно-Уральский государственный медицинский университет" Минздрава России
2 ГБУЗ «Многопрофильный центр лазерной медицины» Министерства здравоохранения Челябинской области
Цель работы – оценить влияние комбинированного применения эритропоэтина (ЭПО) и лазерного излучения (ЛИ) ближнего инфракрасного диапазона на неврологический статус и морфологические изменения в коре головного мозга при экспериментальной ишемии головного мозга (ЭИКГМ). Исследование выполнено на 70 нелинейных крысах. ЭИКГМ моделировали диатермокоагуляцией пиальных сосудов. Через 2 часа после индукции ЭИКГМ проводили облучение области ишемии диодным лазером (длина волны 970 нм) в течение 2 мин; через 3, 24 и 48 ч вводили ЭПО в дозе 5000 МЕ/кг. Неврологический статус животных оценивали по шкале Garcia J. H. В очаге ишемического повреждения на срезах головного мозга подсчитывали на условной единице площади количество нейронов, нейронов с хроматолизом и клеток-теней. Установлено, что при ЭИКГМ на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развиваются поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит, оцениваемый у крыс по шкале Garcia J.H., на 7, 14 и 30 сутки в очаге ишемии коры головного мозга снижается количество нейронов и увеличивается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней. При комбинированном применении ЭПО в суммарной дозе 15000 МЕ/кг и ЛИ при ЭИКГМ улучшается неврологический статус на 1, 3, 7 сутки наблюдения и восстанавливается на 14 и 30 сутки эксперимента; в очаге ишемии коры головного мозга на 7, 14 и 30 сутки снижается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней и увеличивается количество нейронов. При ЭИКГМ на фоне комбинированного применения ЭПО и ЛИ установлена ассоциация между показателем неврологического статуса, оцениваемого по шкале Garcia J. H. и морфометрическими показателями в очаге ишемического повреждения коры головного мозга.
церебральная ишемия
эритропоэтин
лазерное излучение
неврологический статус
морфология
1. Fenjves E.S. Human, nonhuman primate, and rat pancreatic islets express erythropoietin receptors / E.S. Fenjves, M.S. Ochoa, O. Cabrera [et al.] // Transplantation. – 2003. – Vol. 75. – P. 1356-1360.
2. Arcasoy M.O. The non-haematopoietic biological effects of erythropoietin / M.O. Arcasoy // Br. J. Haematol. – 2008. – Vol. 141. – Р. 14-31.
3. McPherson R.J. Erythropoietin for infants with hypoxic-ischemic encephalopathy / R.J. McPherson, S.E. Juul // Curr. Opin. Pediatr. – 2010. – Vol. 22, № 2. – P. 139-145.
4. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на процессы свободнорадикального окисления и экспрессию гликопротеинов в тромбоцитах при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014. – Т. 157, № 1. – С. 30-33.
5. Осиков М.В. Плейотропные эффекты эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.Ф. Телешева, А.А. Федосов, Ю.И. Агеев, Л.Г. Суровяткина // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 7-1. – С. 218-224.
6. Mirza S. The role of interchain heterodisulfide formation in activation of the human common beta and mouse betaIL-3 receptors / S. Mirza, J. Chen, J.M. Murphy [et al.] // J. Biol. Chem. – 2010. – Vol. 285. – P. 24759-24768.
7. Chung H. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy / H. Chung, T. Dai, S.K. Sharma, Y.Y. Huang, J.D. Carroll, M.R. Hamblin // Ann Biomed Eng. – 2012. – V. 40(2). – P.516-533.
8. Головнева Е.С. Механизмы формирования нового сосудистого русла в ответ на высокоинтенсивное лазерное воздействие. Обоснование применения лазерных технологий в хирургии (экспериментальные исследования с внедрением их в клиническую практику) / под ред. А.И. Козеля, Р.У. Гиниатуллина, Е.С. Головневой, Ж.А. Голощаповой. – Челябинск: ООО фирма «Пирс», 2009. – С.125–165.
9. Sautina, L. Induction of nitric oxide by erythropoietin is mediated by the β common receptor and requires interaction with VEGF receptor 2 / L. Sautina, Y. Sautin, E. Beem [et al.] // Blood. – 2010. – Vol. 115. – P. 896-905.
10. Maiese K. Erythropoietin: New Directions for the Nervous System / K. Maiese, Z.Z. Chong, Y.C. Shang [et al.] // Int. J. Mol. Sci. – 2012. – Vol. 13, № 9. – P. 11102-11129.

При ограничении кровоснабжения головного мозга происходит ряд патохимических процессов, приводящих к формированию инфаркта мозга в связи с гибелью клеток путем некроза и апоптоза. Максимально раннее терапевтическое воздействие на зону пенумбры (обратимо поврежденная ишемизированная ткань головного мозга вокруг сформированного очага инфаркта) позволяет сократить площадь потенциально необратимых повреждений в головном мозге и нарушений функций организма. Как правило, в области пенумбры сохранен энергетический метаболизм и присутствуют лишь функциональные изменения, но клетки остаются жизнеспособными с сохранным ионным гомеостазом. Для этого необходимо максимально раннее восстановление адекватной перфузии, а также проведение нейропротекторной терапии, уменьшающей разрушение нейронов вследствие ишемии и деполяризации мембран. Однако эффективность нейропротекторной терапии ишемических повреждений центральной нервной системы (ЦНС) является невысокой, что вызывает необходимость поиска новых методов, подходов для лечения ишемических поражений нервной ткани. В этом отношении внимание привлекает ЭПО – эгликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа, основная часть которого синтезируется пери- и тубулярными клетками почек в ответ на снижение парциального давления кислорода при участии гипоксия-индуцируемого фактора-1. Кроме этого, ЭПО может синтезироваться нейронами, клетками микроглии, гепатоцитами и др. клетками [1]. Основной точкой приложения для действия ЭПО являются клетки эритроидного ряда в костном мозге, где его эффект проявляется в пикомолярных концентрациях. Открытие рецепторов для ЭПО на нейронах позволило обнаружить его новые биологические эффекты [2]. В частности, ЭПО контролирует эмбриональное развитие мозга, способствует восстановлению когнитивной функции и препятствует атрофии при экспериментальном сотрясении мозга, аутоиммунном энцефаломиелите [3]. Ранее нами установлено позитивное влияние ЭПО на аффективный статус, психофизиологический статус, функциональное состояние вегетативной нервной системы у больных с терминальной хронической почечной недостаточности, находящихся на заместительной почечной терапии [4, 5]. Показано, что структура рецептора для ЭПО на неэритроидных клетках отличается от рецептора на клетках-предшественницах эритроцитов, а для его активации требуются наномолярные концентрации ЭПО, что снижает вероятность перекрестных эффектов ЭПО на эндокринном и паракринном уровнях. Полученные данные позволяют рассматривать локальную систему ЭПО-рецептор ЭПО как звено неспецифической защиты при повреждении, а рецепторы ЭПО на неэритроидных клетках обозначаются как защищающие ткань рецепторы. Такие рецепторы по структуре являются гетеродимером, состоящим из субъединиц рецептора ЭПО и βCR (общий рецептор β, CD131), последний также представлен в составе рецепторов для гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-3, интерлейкина-5 [6]. Такой тип рецепторов ЭПО обнаружен в ЦНС и периферической нервной системе, сетчатке и др. тканях. Установлено, что воздействие лазерного излучения (ЛИ) на ткани головного мозга активирует неоангиогенез [7]. В зонах, подвергшихся воздействию ЛИ, увеличивается экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), прежде всего, в сосудах микроциркуляторного русла, что приводит к восстановлению, перфузии тканей, в том числе после ишемии головного мозга [8]. В связи с вышесказанным, клинико-морфологическое исследование нейротропных эффектов комбинированного применения ЭПО и ЛИ представляется актуальным и перспективным в клиническом плане. Цель работы – оценить влияние комбинированного применения эритропоэтина и лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона на неврологический статус и морфологические изменения в коре головного мозга при экспериментальной ишемии головного мозга.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на 70 беспородных половозрелых крысах обоего пола массой 220–250 г. в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики, под общей анестезией препаратом «Золетил» (Virbac «Sante Animale», Фpaнция; 20 мг/кг). Животные были разделены на 3 группы: 1 группа (n=10) – контроль, у животных проводили трепанацию черепа и вскрытие твердой мозговой оболочки без диатермокоагуляции пиальных сосудов (ложнооперированные животные). Группа 2 (n=30) – модель ЭИКГМ создавали путем диатермокоагуляции пиальных сосудов коры головного мозга в сенсомоторной зоне. Группа 3 (n=30) – животные, у которых на фоне ЭИКГМ применяли ЭПО и ЛИ: через 2 часа после индукции ЭИКГМ проводили дистанционное накожное облучение области операции диодным лазером «ИРЭ-ПОЛЮС» (длина волны 970 нм, моноволоконный световод 0,6 мм, мощность 1Вт, экспозиция 2 минуты), через 3, 24 и 48 часов от индукции ИКГМ внутрибрюшинно вводили ЭПО («Эпокрин», ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) в разовой дозе 5000 МЕ/кг, суммарная доза 15000 МЕ/кг. Оценку неврологического статуса проводили на 1, 3, 7, 14, 30 сутки, морфологию очага повреждения – на 7, 14 и 30 сутки после индукции ЭИКГМ. Неврологический дефицит у крыс исследовали с использованием шкалы Garcia J.H. и оценкой следующих параметров: спонтанная активность в клетке за 5 мин; симметричность вытягивания передних конечностей; симметричность движений; способность забираться по стенке проволочной клетки; реакция на прикосновение к каждой стороне туловища; ответ на прикосновение к вибриссам. Максимальный неврологический дефицит – 3 балла, его полное отсутствие – 18 баллов. После выведения животных из эксперимента головной мозг фиксировали, срезы окрашивали по методам Бильшовского и Ниссля. Подсчитывали на микроскопе «Leiсa DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа изображений «ImageScope M» (Россия, Москва) на условной единице площади количество нейронов (неизмененных, с хроматолизом, клеток-теней). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 19. Данные представлены в виде медианы (Ме) и квартилей [Q1-Q3]. Значимость различий между группами оценивали при помощи критериев Крускалла – Уолиса, Манна – Уитни, Фридмана. Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости 0,01.

Результаты исследования. В контрольной группе ложнооперированных животных нами не отмечено значимой разницы между показателями неврологического статуса у крыс по шкале Garcia J.H. на всех сроках наблюдения (табл. 1).

Таблица 1

Влияние комбинированного применения ЭПО и ЛИ на неврологический дефицит по шкале Garcia J.H. при ЭИКГМ (баллы, Me [Q1-Q3])

Группы животных

1 сутки

3 сутки

7 сутки

14 сутки

30 сутки

Группа 1. Контроль

17

[17,00-18,00]

18

[17,00-18,00]

18

[18,00-18,00]

18

[18,00-18,00]

18

[18,00-18,00]

Группа 2. ЭИКГМ

5

[4,00-5,25]

6

[5,00-7,25]

9

[8,00-10,5]

12

[11,0-13,0]

15

[14,0-16,25]

Группа 3.

ЭИКГМ+ ЭПО+ЛИ

8

[6,0-9,0]

13

[11,50-14,00]

15

[13,75-16]

16,5

[15,0-17,0]

17,5

[16,75-18,0]

Различия (критерий Фридмана)

P<0,001

P<0,001

P<0,001

P<0,001

P<0,001

Различия (критерий Манна – Уитни)

P1-2<0,001

P1-3<0,001  

P2-3<0,001  

P1-2<0,001

P1-3<0,001  

P2-3<0,001  

P1-2<0,001

P1-3<0,001  

P2-3<0,001  

P1-2<0,001

P1-3=0,05  

P2-3<0,001

P1-2=0,003 P1-3=0,06

P2-3<0,001

 

Показатель варьировал по медиане в диапазоне 17–18 баллов. В группе животных с ЭИКГМ на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развиваются поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит в виде двигательных, чувствительных и стато-координаторных расстройств, которые медленно и не полностью регрессируют к 30 суткам эксперимента. Количественным эквивалентом изменений неврологического статуса у крыс явилось снижение показателя по шкале Garcia J.H. в 2–3 раза по сравнению с группой ложнооперированных животных, наибольшие изменения зафиксированы на 1–3 сутки, когда показатель составил 5–6 баллов, даже к 30 суткам эксперимента показатель неврологического дефицита не достигал значений в контрольной группе животных (табл. 1). При оценке морфологических изменений при экспериментальной ЭИКГМ в очаге ишемического повреждения головного мозга обнаружены изменения количественного представительства интактных нейронов, а также нейронов с признаками повреждения (табл. 2).

Таблица 2

Влияние комбинированного применения ЭПО и ЛИ на морфометрические показатели в очаге повреждения при ЭИКГМ (количество клеток / у.е. площади, Me [Q1-Q3])

Группы / Показатели

Группа 2. ЭИКГМ

Группа 3. ЭИКГМ + РЭП+ЛИ

7 сутки

14 сутки

30 сутки

7 сутки

14 сутки

30 сутки

Интактные нейроны

36,50 [30,87-42,77]

30,38 [23,08-36,39]

25,21 [15,96-32,29] #

92,95 [91,34-3,85] *

95,71 [90,40-6,67] *

99,67

[95,12-103,01] *

Нейроны с хроматоли-зом

25,94 [25,21-26,73]

34,10 [32,03-35,09] #

42,10 [40,45-43,10] #

8,13

[7,57-8,69] *

6,17

[6,00-7,12] *

3,93

[3,64-4,40]

*

Клетки- тени

62,25 [58,08-66,84]

70,75 [67,04-72,68] #

76,35 [70,77-78,01] #

7,23

[6,18-7,66] *

3,84

[3,60-4,75] *

2,05

[1,87-2,39]

*

Примечание. * – статистические значимые (р<0,01) различия с группой 2 на соответствующие сутки, # – при сравнении с 7 сутками в группе 2.

Так, в динамике наблюдения 7–30 суток выявлено прогрессивное снижение количества интактных нейронов, статистически значимое на 30 сутки по сравнению с 7 сутками, а также увеличение количества нейронов с хроматолизом и клеток-теней на 14 и 30 сутки по сравнению с 30 сутками после ЭИКГМ.

Обнаруженные изменения неврологического статуса и морфологии очага повреждения при экспериментальной ЭИКГМ являются отражением ограничения кровотока, ишемии сенсомоторной зоне коры больших полушарий головного мозга и гипоксического некробиоза нейронов. Показательно, что формирование инфаркта происходит в течение 28–72 ч с момента развития инсульта, возможно, и дольше с учетом влияний сохраняющегося отека мозга и других отдаленных последствий ишемии.

Комбинированное применение ЭПО и ЛИ при экспериментальной ЭИКГМ приводит к существенному изменению неврологического статуса, оцениваемого по шкале Garcia J.H. (табл. 1). Так, уже через 1 сутки после индукции ЭИКГМ, применения ЛИ и однократного введения ЭПО наблюдается статистически значимое увеличение показателя неврологического статуса по сравнению с группой животных с ЭИКГМ. Такая тенденция сохраняется на 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения, причем на 14 и 30 сутки не обнаружено статистически значимых изменений показателя неврологического статуса по сравнению с контрольной группой животных, что позволяет говорить о полном восстановлении неврологического статуса после комбинированного применения ЭПО и ЛИ. При морфометрическом исследовании препаратов головного мозга животных с ЭИКГМ установлено, что, начиная с 7 суток, снижается по сравнению с контрольной группой количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней, соответственно в 3,2 раза и 8,6 раза. Количество интактных нейронов на условной единице площади возрастало на 7 сутки 2,5 раза, на 14 сутки – в 3,2 раза по сравнению с контрольной группой крыс с ЭИКГМ. На 30 сутки количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней достигало минимальных значений и снижалось в 10,7 раза и 31, 2 раза соответственно по сравнению с группой крыс с ЭИКГМ, а количество интактных нейронов примерно в 4 раза превышало значения у крыс с церебральной ишемией без лечения.

Установлено с использованием методов корреляционного анализа, что у крыс с ЭИКГМ на фоне комбинированного применения ЭПО и ЛИ на 7, 14, 30 сутки показатель неврологического статуса нарастает по мере увеличения количества интактных нейронов в очаге церебрального ишемического повреждения (соответственно R=0,62; р<0,05; R=0,71; р<0,05; R=0,85; р<0,05), снижения количества нейронов с хроматолизом (соответственно R=-0,49; р<0,05; R=-0,49; р<0,05; R=-0,68; р<0,05) и снижения количества клеток-теней (соответственно R=-0,44; р<0,05; R=-0,44; р<0,05; R=-0,65; р<0,05).

Улучшение неврологического статуса по шкале Garcia J.H. и изменение морфометрических показателей в очаге ишемического повреждения у животных с ЭИКГМ после применения ЭПО и ЛИ, возможно, связано с синергетическими эффектами ЛИ и ЭПО. Восстановление кровотока и нейропротекторные эффекты комбинированного применения ЭПО могут быть обусловлены несколькими механизмами. Во-первых, вазотропными эффектами ЭПО и улучшением кровоснабжения ишемизированной области. Установлено, что в эндотелиоцитах в условиях гипоксии комплекс рецептора ЭПО и βCR соединяется с рецептором для фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF). Такое взаимодействие необходимо для стимуляции неоангиогенеза церебральных сосудов и ЭПО-опосредованной продукции NO эндотелиоцитами [9]. Кроме этого, в отношении эндотелиоцитов ЭПО оказывает пролиферативный и хемотаксический эффекты, особенно выраженные в постишемическом периоде. Во-вторых, нейротропными эффектами ЭПО. Так, нейропротекторный эффект ЭПО реализуется за счет препятствия апоптозу нейронов в условиях гипоксии. Наряду с этим, ЭПО стимулирует функцию нейронов, улучшает их жизнеспособность через активацию Са-каналов и высвобождение нейромедиаторов, является антагонистом глутамата, регулирует продукцию нейромедиаторов, увеличивает активность антиоксидантных ферментов, тормозит NO-зависимые свободнорадикальные процессы. Кроме этого, ЭПО регулирует созревание и дифференцировку олигодендроглии и пролиферацию астроцитов, оказывает антиапоптический эффект на клетки микроглии.

Внутриклеточная трансдукция сигнала после связывания ЭПО с рецептором обеспечивается Jak-2-зависимыми сигнальными путями: трансдукторы сигналов и активаторы транскрипции (STAT-5, STAT-3), фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), протеинкиназа В (РКВ), гликоген-синтаза киназа-3β (GSK-3β), митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) и др. [10]. Так, STAT-5 приводит к активации антиапоптогенных генов и генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток. PI3K, РКВ и MAPK подавляют активность GSK-3β, что приводит к стабилизации мембраны митохондрий (сохранение потенциала митохондриальной мембраны), снижению выхода цитохрома с и Apaf-1-зависимой активации каспаз. Кроме того, снижение активности GSK-3β угнетает NFκB-зависимый синтез провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИЛ6, ТНФ-α, MCP-1 и др. С другой стороны, РКВ опосредует синтез eNOS в эндотелиальных и др. клетках.

Выводы

  1. При экспериментальной ишемии коры головного мозга на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развиваются поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит, оцениваемый у крыс по шкале Garcia J.H., на 7, 14 и 30 сутки в очаге ишемии коры головного мозга прогрессивно снижается количество интактных нейронов, а также увеличивается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней.
  2. При комбинированном применении эритропоэтина в суммарной дозе суммарная доза 15000 МЕ/кг и лазерного излучения при экспериментальной ишемии коры головного мозга установлено улучшение неврологического статуса крыс на 1, 3, 7 сутки наблюдения и его восстановление на 14 и 30 сутки эксперимента; в очаге ишемии коры головного мозга на 7, 14 и 30 сутки прогрессивно снижается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней и увеличивается количество интактных нейронов.
  3. При экспериментальной ишемии коры головного мозга на фоне комбинированного применения эритропоэтина и лазерного излучения установлена ассоциация между показателем неврологического статуса, оцениваемого по шкале Garcia J. H., и морфометрическими показателями в очаге ишемического повреждения коры головного мозга.

Библиографическая ссылка

Осиков М.В., Гиниатуллин Р.У., Кузьмин А.Н. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И МОРФОЛОГИЮ ОЧАГА ПОВРЕЖДЕНИЯ В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 5.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26782 (дата обращения: 23.07.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252