Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

ХАРАКТЕРИСТИКИ АКТИВНОСТЕЙ МОНОАМИНООКСИДАЗ И СОДЕРЖАНИЯ ПРОДУКТОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНОГО СТРЕССА

Аллилуев А.В. 1 Цейликман О.Б. 2 Лапшин М.С. 2 Комелькова М.В. 2 Деев Р.В. 1
1 ФГБОУ ВО «Южноуральский Государственный медицинский университет Минздрава России»
2 ФАГОУ ВО «Южно-Уральский государственный университет» (Национально-исследовательский университет)
У крыс спустя 3 суток после завершения повторных стрессорных воздействий, вызванных запахом хищника, наблюдаются нарушения поведенческой активности в виде снижения более чем в 2 раза количества вертикальных стоек и уровня анксиогенной дефекации. Кроме того, в этот период отмечено снижение активности моноаминооксидазы А (МАО-А) при одновременном снижении содержания молекулярных продуктов ПОЛ. В частности, отмечено снижение гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряженных триенов. В пределах общей выборки на основании теста крестообразный лабиринт выделены подгруппы животных с повышенной тревожностью и нормальной тревожностью. Оказалось, что только у животных с повышенной тревожностью наблюдалось снижение активности МАО-А при одновременном повышении ПОЛ в системе Fe2+/аскорбат. Одновременно наблюдалось снижение вертикальной активности и интенсивности реакции замирания. У животных со сниженной тревожностью подобные сдвиги отсутствовали.
мао
свободнорадикальное окисление
тревожность
стресс
1. Волчегорский И.А. Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптационных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников, В.Э. Цейликман. – Челябинск, 2000. – 167 с.
2. Горкин В.З. Система амноксидаз: современные достижения в исследованиях природы, функций и их нарушений/ В.З. Горкин, Л.Н. Овчинникова // Биомедицинская химия. – 1993. – Т. 39. – С. 2-10.
3. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико- биохимические аспекты / Е.Е. Дубинина. – СПб.: Изд-во Медицинская пресса, 2006. – 397 с.
4. Львовская Е.И. Нарушение процессов липидной пероксидации при термической травме и патогенетическое обоснование лечения антиоксидантами из плазмы крови: автореф. дис. … д-ра мед. наук / Е.И. Львов¬ская. – Челябинск, 1998. – 45 с.
5. Синицкий А.И. Особенности свободнорадикального окисления при гипо- и гиперкортикоидных состояниях: дис. ... д-ра мед. наук /А.И. Синицкий. – Челябинск, 2013. – 32 с.
6. Chen K. Transcription factor E2F-associated phosphoprotein (EAPP), RAM2/CDCA7L/JPO2 (R1), and simian virus 40 promoter factor 1 (Sp1) cooperatively regulate glucocorticoid activation of monoamine oxidase B / K. Chen, X.M. Ou, J.B. Wu, J.C. Shih // Mol. Pharmacol. 2011. Feb. 79(2). P. 308-317.
7. Cohen H. The neuropeptide Y (NPY) – ergic system is associated with behavioral resilience to stress exposure in an animal model of post-traumatic stress disorder/ H. Cohen, T. Liu, N. Kozlovsky, Z. Kaplan, J. Zohar, A.A. Mathé // Neuropsychopharmacology. 2012. Jan. 37(2). P. 350-363.
8. Jones D.P. Radical-free biology of oxidative stress / D.P. Jones // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2008. Vol. 295. Р. 849-868.
9. Ou X.M. et al. A novel role for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and monoamine oxidase B cascade in ethanol-induced cellular damage/ X.M. Ou, C. Johnson, M.B.H. Youdim, M.C. Austin, J. Luo, A. Sawa // Biological psychiatry. 2010. Vol. 67. No. 9. P. 855-863.
10. Sergutina A.V. Differences in monoamine oxidase activity in the brain of wistar and august rats with high and low locomotor activity: a cytochemical study./ A.V. Sergutina, V.I. Rakhmanova // Bull. Exp. Biol. Med. 2016. Jun. 161(2). P. 211-4.
11. Shih J.C. Transcriptional regulation and multiple functions of MAO genes / J.C. Shih, J.B. Wu, K. Chen // J. Neural. Transm. 2011. Jul. 118(7). P. 979-86.
12. Yehuda R., Seckl J. Minireview: Stress-related psychiatric disorders with low cortisol levels: a metabolic hypothesis. Endocrinology. 2011. 152. P. 4496-4503.
13. Zoladz P.R., Fleshner M., Diamond D.M. () Psychosocial animal model of PTSD produces a long-lasting traumatic memory, an increase in general anxiety and PTSD-like glucocorticoid abnormalities. Psychoneuroendocrinology. 2012. 37. P. 1531–1545.

Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) является отдаленным последствием психической травмы [12]. Развитие ПТСР происходит через значительный промежуток времени после пребывания организма в экстремальных условиях. Для экспериментального моделирования ПТСР весьма удобна модель психоэмоционального стресса, вызванного сигналом о присутствии хищника [7]. Такая постановка стресса полностью исключает наличие у животных физических страданий. Поэтому данная ситуация имеет психотравмирующий характер и может характеризовать наличие ПТСР [13]. Однако далеко не все животные, подвергнутые психоэмоциональному стрессу, отличаются наличием ПТСР симптоматики. Для идентификации наличия или отсутствия ПТСР симптомов среди животных широко распространен анализ уровня тревожности в открытых рукавах крестообразного лабиринта. Соответственно, высокотревожные животные (ВТ) имеют ПТСР симптоматику, а у животных с низкой тревожностью (НТ) она отсутствует. В основе биологических эффектов эндогенных медиаторов тревожности трибулинов лежит ингибирование моноаминооксидаз (МАО). Моноаминооксидазы (МАО) – A и B участвуют в окислительном дезаминировании биогенных аминов. Кроме того, копродуктом МАО-реакции является перекись водорода (Н2О2), которая в присутствии металлов с переменной валентностью вовлекается в процессы свободнорадикального окисления [2, 8]. В ЦНС с активацией МАО связано развитие нейродегенеративных процессов. Однако до сих пор не изучена направленность изменений активности МАО после завершения психоэмоционального стресса у ВТ и НТ крыс. В данном исследовании мы изучали уровень активностей МАО-A и МАО-B и уровень основных звеньев свободнорадикального окисления: перикисного окисления липидов и карбонилирования белков в головном мозге ВТ и НТ крыс после завершения психоэмоционального стресса.

Материалы и методы

Работа выполнена на 32 белых беспородных лабораторных крысах. Психоэмоциональный стресс (n=16) моделировался запахом мочи кошки, ежедневно на протяжении 15 минут в течение 10 суток. Экспериментальная группа после 10-суточного воздействия стрессора содержалась в течение 3 суток в стандартных условиях. В контрольную группу вошли животные (n=16), которые не подвергались воздействию стрессора. Поведенческая активность животных определялась в тестах открытое поле и приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ). По времени пребывания в открытых рукавах ПКЛ животных разделяли на ВТ и НТ.

В гомогенатах головного мозга исследовали активности ферментов МАО-A и МАО-B, содержание карбонилированных белков, как показателя окислительной деструкция белков, а также молекулярных продуктов ПОЛ [1]. Для определения МАО-активности использовали 12.5 % (вес: объём) гомогенат головного мозга на 0,067М Na-фосфатном буфере (рН = 7,4) на сахарозе 0,25М. Далее его центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, отбирали надосадочную жидкость и в течение 25 минут при 850 g центрифугировали. В полученной суспензии митохондрий определяли активности ферментов МАО-A и МАО-B. В качестве субстрата использовали серотонин и бензиламин гидрохлорид.

Для определения активности МАО-A в пробирку вносили 0,2 мл гомогената, который предварительно центрифугировали в течение 15 минут. Далее супернатант смешивали с 2,3 мл Na-фосфатным буфером (0,067М) и преинкубировали 30 минут при температуре 37 °С. Затем в опытные пробы добавляли 0,5 мл серотонина (3 мкМ раствора) и инкубировали в течение 30 минут при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл раствора семикарбазида на хлорной кислоте (25 мМ). Одновременно, в качестве контроля была поставлена проба, в которую не вносили субстрат в фазу инкубации, а добавляли его после остановки реакции. Для определения активности МАО-B использовалась та же методика, но в качестве субстрата использовался бензиламингидрохлорид.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов оценивали спектрофотометрическим методом, предварительно экстрагируя липиды исследуемых тканей в смеси гептана и изопропанола [1]. Определение содержания конечных продуктов ПОЛ и интенсивность аскорбат-индуцированного ПОЛ осуществляли методом Львовской Е.И и соавт. [4]. Данные методики позволяют идентифицировать полярные липиды, растворимые в изопропиловом спирте, и неполярные липиды, растворимые в гептане; оценить содержание первичных продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты), вторичных продуктов ПОЛ (кетодиены и сопряженные триены) и конечных продуктов ПОЛ (основания Шиффа). Показатели окислительной модификации белков (ОМБ) в изучаемых образцах оценивали по образованию динитрофенилгидразонов [3].

Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна – Уитни (U).

Результаты и обсуждение

В общей выборке животных, уже спустя 3 суток после завершения повторных стрессорных воздействий, наблюдаются нарушения поведенческой активности в виде снижения более чем в 2 раза количества вертикальных стоек и уровня анксиогенной дефекации (таблица 1). Остальные показатели поведенческой активности не отличались статистически значимо от контроля. Кроме того, в этот период отмечено снижение активности МАО-A при наличии дисбаланса в содержании молекулярных продуктов ПОЛ. В частности, отмечено снижение гептан-растворимых диеновых конъюгатов и повышение содержания кетодиенов и сопряженных триенов.

Через 3 суток после завершения стрессорных воздействий у НТ животных наблюдалось снижение времени пребывания в открытых рукавах крестообразного лабиринта, при одновременном снижении вертикальной активности (таблица 2). При этом, у них не снизился уровень активности МАО-A. Уровень ПОЛ у них также находился в пределах контрольных значений. У ВТ животных, по сравнению с контролем в тесте открытого поля, снижена интенсивность реакции замирания. Одновременно у ВТ крыс, по сравнению с контролем, снижена активность МАО-A. При этом наблюдались положительные корреляции между уровнем активности МАО-A и поведенческими показателями, характеризующими сниженную тревожность.

Таблица 1

Влияние психоэмоционального стресса на показатели поведенческой активности, уровень активности МАО-A и МАО-B и показатели свободнорадикального окисления головного мозга

Показатели

Контроль

Стресс

Время в открытых рукавах (сек)

40,25±7,08

66,50±10,22

Вертикальная активность (количество стоек)

9,5±0,4

4,1 ±0,1*

Количество фекальных болюсов

1,75±0,036

0,25±0,01*

Время в закрытых рукавах

484,25±52,84

437,38±84,45

Время в центре

75,5±17,16

96,125 ±28,04

Активность МАО-A (нМ/мин/мг белка)

1,44±0,07

0,94±0.012*

Активность МАО-B(нМ/мин/мг белка)

1,12±0,21

1,33±0,33

Диеновые конъюгаты

Гептановая фаза (у.е.о)

0,85±0,07

0,81±0,06*

Кетодиены и сопряженные триены

Гептановая фаза (у.е.о)

0,097±0,015*

0,12±0,019*

Fe2+/аскорбат индуцированное

ПОЛ (у.е.о)

2,56±0,23

2,48±1,23

Карбонилированные белки

(мМ/мкг белка)

0,0043±0,002

0,0041±0,003

Карбонилированные белки индуцированное

(мМ/мкг белка)

0,0151±0,003

0,0184±0,002

Количество умываний

1,25±1,26

2,25±1,28

Количество свисаний

7,25± 0,93

8,62±   0,85

Примечания: Данные представлены в виде средней арифметической величины и ошибки средней (M±m),

*статистически значимые различия по сравнению с контролем,

у.е.о. – условные единицы окисления, выражаемые как отношение Е232/Е220 для диеновых конъюгатов и Е278/Е220 для кетодиенов и сопряженных триенов.

 

В частности обнаружены корреляции между:

- МАО-A и временем проведения в светлом лабиринте (rs=0,833);

- МАО-A и свисанием (rs=0,718);

-МАО-A и процент времени в открытом поле (rs=0,833);

-МАО-A и время проведения в центре арены (rs=0,755).

Особенный интерес вызывает корреляционная зависимость между уровнем активности МАО-A и временем нахождения в открытых рукавах крестообразного лабиринта. Именно по этому показателю поведенческой активности проводилось разделение животных на восприимчивых и устойчивых к ПТСР. Соответственно просматривается закономерность – чем выше уровень активности МАО, тем больше времени животные проводят в открытых рукавах, то есть тем ниже будет общий уровень тревожности. Скорее всего нейрохимической основой подобной корреляционной связи является ключевая роль МАО в обмене биогенных аминов-нейротрансмиттеров. Соответственно на сниженном уровне МАО возможно повышение уровня серотонина, дофамина и норадреналина. В случае, если это будет сопровождаться угнетением ГАМК-ергической системы, вполне ожидаемо развитие тревожной симптоматики. В связи с этим стоит обратить внимание на положительную корреляцию между уровнем активности МАО-A и уровнем свисаний. Вполне возможно, что этот показатель характеризует склонность к реализации активных поведенческих стратегий в виде «реакции борьба-бегство». Интересно отметить, что ингибиторы МАО не нашли применения в психиатрии в качестве анксиолитиков, зато эффективно используются как антидепрессанты. По данным метаанализа ингибиторы МАО не проявили себя эффективными средствами в коррекции ПТСР, и представленные здесь результаты позволяют понять причину их неэффективности.

Кроме того, в головном мозге наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых вторичных продуктов ПОЛ (кетодиенов и сопряженных триенов), а также изопропанол-растворимых первичных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) после индукции в системе Fe2+/аскорбат. У НТ животных, по сравнению с контролем, повышено время пребывания в светлом лабиринте и время пребывания в центре, по сравнению с контролем. Кроме того, у НТ животных повышено содержание гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов. Таким образом, спустя 3 дня после завершения повторных стрессорных воздействий наблюдается снижение активности МАО-A в головном мозге при одновременном повышении содержания молекулярных продуктов ПОЛ. Это свидетельствует о том, что активация ПОЛ в головном мозге осуществляется по МАО-независимому механизму.

Вполне возможно, что усиление ПОЛ при психоэмоциональном стрессе имеет цитокин-зависимый характер. Известно, что усиление ПОЛ является одной из составляющих трансдукции цитокинового сигнала, а на фоне сниженного уровня глюкокортикоидов создаются благоприятные возможности для развития гиперцитокинемии.

Таблица 2

 Постстрессорные показатели поведенческой активности, уровень активности МАО-A и МАО-B, показатели свободнорадикального окисления головного мозга у ВТ и НТ крыс

Показатели

Контроль

ВТ

НТ

Время в открытых рукавах (сек)

40,25±7,08

33,75± 5,59    

99,25±5,90*#

 

Вертикальная активность (количество стоек)

9,25±0,4

5,25±0,27      

3,25±0,5*

Количество замираний

14,00±1,25

6,5±0,89*#

14,00±3,25

Активность МАО-A

(нМ/мин/мг белка)

1,44±0,07

0,72±0,02*

1,17±0,11

Активность МАО-B

(нМ/мин/мг белка)

1,12±0,21

1,04±0,36

1,21±0,49

Кетодиены и сопряженные триены

(гептановая фаза)

0,097±0,015

0,14±0,01*

0,11±0,01

Fe2+/аскорбат индуцированное ПОЛ

2,48±0,23

2,64±0,08*

2,50±0,3

Примечания:

Данные представлены в виде средней арифметической величины и ошибки средней (M±m),

*статистически значимые различия по сравнению с контролем,

# статистически значимые различия между ВТ и НТ крысами. 

 

Причиной сниженного уровня активности МАО может быть типичный для этой модели ПТСР сниженный уровень глюкокортикоидов. Известно, что глюкокортикоиды обладают способностью, как повышать, так и понижать каталитическую активность МАО.

В настоящее время расшифрованы молекулярные механизмы, с помощью которых глюкокортикоиды регулируют экспрессию МАО. В частности, на промоторе гена МАО-A имеются несколько сайтов связывания с глюкокортикоид-респонсивным элементом′-GGTACAnnnTGTTCT-3′ и с транскрипционным фактором Sp1 [6 11]. Соответственно, связывание данного транскрипционного фактора приводит к подавлению экспрессии МАО-A. Открытый транскрипционный фактор R1(RAM2/CDCA7L), к примеру, связываясь с Sp1 сайтами, подавляет экспрессию гена МАО А [6]. Также, было установлено, что RAM2/CDCA7L ингибирует не только экспрессию гена МАО-A, но и угнетает экспрессию МАО-B. Регуляцию экспрессии МАО-B дополнительно осуществляет ещё один транскрипционный фактор – E2F ассоциированный фосфопротеин (EAPP). Выявлено, что супрессивный эффект глюкокортикоидов на экспрессию МАО-B обусловлен положительным влиянием EAPP [9]. Вместе с тем глюкокортикоиды характеризуются способностью угнетать каталитическую активность моноаминооксидаз [10]. Это явление, скорее всего, связано с глюкокортикоид-зависимым влиянием на микроокружение МАО. МАО является митохондриальным ферментом, а глюкокортикоиды способны угнетать функциональную активность митохондрий. Помимо этого, экспрессия МАО-A угнетается путём глюкокортикоид-зависимой стимуляции транслокации R1 из цитоплазмы в ядро [5]. Однако, в условиях выполненного исследования, активность МАО может быть снижена вследствие блокады глюкокортикоид-зависимых механизмов усиления экспрессии МАО.

Наблюдаемые поведенческие и нейрохимические особенности общей выборки проявлялись асимметрично у ВТ и НТ животных. В этот период у НТ животных повысилось, по сравнению с контролем, время пребывания в светлых рукавах, а у ВТ животных отсутствовали статистически значимые различия. Таким образом, характерные для общей выборки анксиолитические изменения поведенческой активности появляются исключительно благодаря НТ животным. Причем НТ животным вовсе не свойственно снижение активности МАО-A. Более того, уровень активности МАО-B был снижен только у ВТ животных. Полученный результат можно интерпретировать как проявление связи между снижением активности МАО и ростом тревожности. В связи с этим стоит обратить внимание на наличие в органах эндогенных ингибиторов активности МАО, называемых трибулинами, которые рассматриваются в качестве медиаторов тревожности. Вполне возможно, что у ВТ животных снижение активности МАО-A связано с приростом трибулиновой активности. На сегодняшний день можно постулировать наличие двух основных механизмов снижения активности МАО. Первый механизм связан со снижением экспрессии МАО. Исходя из того, что глюкокортикоиды играют ключевую роль в усилении экспрессии МАО-A, на фоне их сниженного содержания представляется вполне допустимым снижение экспрессии МАО за счет снижения уровня целого ряда глюкокортикоид-зависимых транскрипционных факторов, таких как KLF-11 или E2F [9]. Для реализации второго механизма не обязательно снижение экспрессии МАО. Тут вполне достаточно усиления трибулиновой активности. В наших исследованиях сниженный уровень МАО активности может быть реализован как по первому, так и по второму механизму. Выяснение роли каждого из них в снижении активности МАО-A может послужить предметом для дальнейших исследований.

Исследование выполнено при поддержке Российского Научного Фонда: Грант № 17-15-013418.


Библиографическая ссылка

Аллилуев А.В., Цейликман О.Б., Лапшин М.С., Комелькова М.В., Деев Р.В. ХАРАКТЕРИСТИКИ АКТИВНОСТЕЙ МОНОАМИНООКСИДАЗ И СОДЕРЖАНИЯ ПРОДУКТОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНОГО СТРЕССА // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 5.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=26985 (дата обращения: 25.04.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252