С момента открытия присутствия в крови и других биологических жидкостях (ликворе, лимфе, моче и т.д.) человека внеклеточных или циркулирующих нуклеиновых кислот (вкНК) проводятся исследования не только их биологической роли, но и возможности использования в качестве диагностических показателей при различных патологических состояниях. вкНК рассматриваются как потенциальные диагностические, прогностические и предиктивные биомаркеры рака [1; 2]. Leon S.A. и соавт. [3] установили увеличение концентрации вкДНК в крови больных со злокачественными новообразованиями с различной локализацией опухоли (колоректальный рак, рак легких, молочной железы, желудка и пищевода и др.) по сравнению со здоровыми лицами. Было показано, что в сыворотке крови у больных с онкологическими заболеваниями концентрация внДНК варьировала в пределах от 50 до 5000 нг/мл, тогда как у лиц контрольной группы – не превышала 50 нг/мл [4].
Поскольку вкДНК имеют достаточно короткий период полувыведения из организма, то, по мнению Leon S.A. и соавт. [3], её можно рассматривать как маркер опухолевой нагрузки.
Abo-El-Eneen M.S. и соавт. [5] показали, что концентрация вкДНК в крови больных со злокачественными новообразованиями превышала не только аналогичный показатель здоровых лиц, но и больных с доброкачественными опухолями. После лучевой терапии уровень вкДНК снижался у больных раком легких, яичников, матки, молочной железы и др., но степень снижения существенно варьировала. У больных, у которых отсутствовал ответ на противоопухолевую терапию, содержание вкДНК в сыворотке крови сохранялось на высоком уровне или продолжало возрастать. Показано, что больные, у которых после лечения сохранялся высокий уровень вкДНК, имели более плохой прогноз [4; 6; 7]. Проведен анализ содержания вкДНК в крови больных после хирургического лечения опухолей. У больных без рецидивов после хирургического лечения содержание вкДНК снижалось. У больных, у которых заболевание прогрессировало, уровень вкДНК оставался высоким [8].
До сих пор нет единого мнения по вопросу, что лучше использовать для определения вкНК – плазму или сыворотку крови. Содержание вкДНК в сыворотке крови существенно превышает таковое в плазме за счет выхода вкДНК из погибающих в процессе свертывания крови лейкоцитов [4].
Было предложено использовать определение концентрации вкНК в плазме/сыворотке крови больных для скрининга некоторых видов рака (рак легких, рак молочной железы и колоректальный рак). В качестве аргумента приводили результаты, полученные Frattini M. et al., которые показали, что количественное определение вкДНК в плазме крови больных с колоректальным раком является более чувствительным методом, чем раково-эмбриональный антиген [9; 10].
Hashad D. et al. выявили взаимосвязь между стадией, размером опухоли и увеличением вкДНК в крови больных раком молочной железы [11]. Вместе с тем опубликованы и другие данные, которые не выявили взаимосвязи между уровнем вкДНК, размером и локализацией опухоли. Кроме того, был установлен существенный рост концентрации вкНК в крови при других патологических состояниях (воспаление, сепсис), после тяжелой физической нагрузки, а также у пожилых людей. Другим фактором, ограничивающим внедрение количественного определения вкДНК в клинике, является проблема стандартизации методов. В связи с этим применение количественной оценки вкДНК как маркера онкопатологии на сегодняшний день не рекомендовано к использованию в клинике [12].
Развитие методов генетических исследований позволило вывести анализ вкНК на новый уровень. Достигнуты определенные успехи в идентификации типов вкНК в биологических жидкостях больных различными видами раков. Stroun и соавторы [13] высказали предположение, что часть вкДНК, которая определяется в плазме крови больных, имеет опухолевое происхождение. Friel A.M. et al. [14] сообщили о появлении в крови больных специфических mRNA, ассоциированных с наличием рака молочной железы. Fleischhacker M. и Schmidt B. [15] показали, что циркулирующие нуклеиновые кислоты в крови онкологических больных имеют опухолевое происхождение, причем опухоль-ассоциированные изменения определяются как в вкДНК, так и в вкРНК. При этом фракция циркулирующей опухолевой ДНК часто может составлять менее 1% от общей вкДНК [16]. Установлено, что во вкДНК обнаруживаются нарушения, идентичные таковым как в первичной опухоли, так и в метастазах. В вкДНК обнаружены точечные мутации, микросателлитные повторы, инверсии и делеции. Микросателлитные повторы состоят из коротких ди-, три-, тетра-, пента- или гексануклеотидов, продублированных от нескольких до сотен раз. Увеличение количества микросателлитных повторов выше определенного порогового значения и их расположение в геноме приводит к развитию генетических дефектов. Кроме того, в вкДНК обнаружено гиперметилирование промотерных последовательностей. В плазме крови вкДНК также могут присутствовать в комплексе с нуклеосомами, митохондриальные ДНК [17]. Обсуждается их возможный прогностический и предиктивный потенциал, а также использование как инструмента для мониторинга последующей терапии.
Была сформулирована гипотеза генометастазов [18], согласно которой ДНК из опухолевых клеток способна проникать в здоровые клетки и индуцировать злокачественную трансформацию последних, что в конечном итоге приводит к образованию метастазов.
Помимо внеклеточных ДНК, проводится изучение внеклеточных РНК, главным образом microRNA. microRNA – это маленькие некодирующие одноцепочечные молекулы РНК. microRNA вовлечены в разнообразные процессы, включая иммунный ответ, репарацию ДНК, апоптоз, реакции окислительного стресса. Достаточно большое количество microRNA найдено в биологических жидкостях. Основная функция циркулирующих microRNA – обеспечение внеклеточной коммуникации, что играет важную роль в дифференциации и пролиферации. Высказано предположение о существовании активного механизма высвобождения внеклеточных microRNA, в частности посредством церамид-зависимого секреторного механизма. miRNA циркулирует в плазме крови в комплексе с липопротеинами, апоптотическими тельцами, микровезикулами или экзосомами, что делает их достаточно стабильными [19].
Дизрегуляция microRNA играет важную роль в инициации, развитии и прогрессировании некоторых видов рака у человека. Исследование microRNA является перспективным для ранней диагностики, прогноза и лечения злокачественных новообразований. На сегодняшний день предложено определение в сыворотке или плазме по меньшей мере 79 microRNA в качестве биомаркеров солидных или гематологических опухолей [19]. Получены предварительные данные о том, что циркулирующие microRNA могут быть маркерами предрасположенности к онкопатологии. Вполне вероятно, что сами циркулирующие microRNA могут быть потенциальными мишенями для лечения отдельных видов рака.
Обсуждается гипотеза о механизме передачи опухолевых сигнальных молекул при участии экзосом, в составе которых выявлены мРНК и микроРНК. При этом микроРНК подавляют иммунный ответ [20]. Бондарь Г.В. и соавт. (2013) высказали мнение, что внеклеточные нуклеиновые кислоты могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на иммунную систему. Эффект определяется нуклеотидной последовательностью вкНК, метилированием, а также зависит от того, находится ли вкНК в составе белкового комплекса [21].
Исследованиями Е.Ю. Рыковой и соавт. (2008) показано, что у 13% женщин с фиброаденомой и у 60% больных раком молочной железы в вкДНК плазмы крови встречается метилированная форма одного из трех генов опухолевой супрессии RASSF1A, Cyclin D2, RARb2. Если для исследования методом метил-специфичной полимеразной цепной реакции использовали суммарную вкДНК (вкДНК плазмы крови и из элюатов с форменных элементов клеток крови) метилированные формы этих генов выявляются у 95% женщин с раком молочной железы и у 87% с фиброаденомой молочной железы. Эти же авторы, используя метод количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, установили достоверное увеличение количества копий 18S рРНК и мРНК генов RASSF8 и Ki-67 в крови больных раком молочной железы по сравнению с аналогичными параметрами группы контроля и с фиброаденомой. Чувствительность метода анализ 18S рРНК в плазме крови составила 82%, специфичность 92% [22].
У 83% больных колоректальным раком мутации гена KRAS обнаружены не только в тканях, но и в циркулирующей вкДНК. Помимо этого, у 27% здоровых доноров также обнаружены мутантные гены KRAS в циркулирующей вкДНК, хотя онкологического процесса выявлено не было. Авторы исследования высказали предположение, что это может быть связано с более высоким риском развития колоректального рака [23]. Было показано, что совместное определение наличия мутантных генов KRAS в циркулирующей вкДНК и увеличение опухолевого маркера СА 19-9 в крови позволяют повысить чувствительность прогностического теста до 90% [24].
Получены интересные результаты о формах существования вкНК в крови онкобольных. Под действием экзонуклеаз вкДНК распадается на короткие олигомерные последовательности, которые связываются с эритроцитами. Связывание с эритроцитами олигонуклеотидов предотвращает появление в крови больных мононуклеотидов и продуктов их катаболизма, которые выполняют функцию аларминов. вкНК могут образовывать комплексы с лейкоцитами, что объясняет возможный механизм переноса ДНК опухолевых клеток в ткани, учитывая способность лейкоцитов к миграции [25].
Г.В. Бондарь и соавт. (2013) также показали более высокий уровень внНК опухолевого генеза в эритроцитарной фракции онкобольных. Кроме того, этими авторами установлено присутствие в эритроцитарной фракции высокомолекулярных последовательностей L1, продукты которой обладают эндонуклеазной активностью и участвуют в деградации внеклеточных нуклеиновых кислот опухолевого происхождения [21].
По данным С.Н. Тамкович и соавт. (2005) [26], в крови больных раком молочной железы не обнаружены вкНК, связанные с поверхностью клеток. У больных раком толстой кишки и раком желудка происходит снижение внРНК, связанных с клетками крови, по сравнению с группой контроля. Не было обнаружено зависимости степени увеличения вкНК от стадии заболевания и размера опухоли. В то же время опубликованы данные о снижении внНК, связанных с эритроцитами, в крови женщин с раком молочной железы относительно контроля [27].
Показано, что вкДНК – олигомеры могут связываться с белками, в частности с альбумином, фибронектином, лактоферрином и др. Приблизительно 1.5% белков плазмы крови обладают способностью связывать вкНК. Химическая модификация вкДНК оказывает безусловное влияние на их свойства. С клетками крови (эритроцитами и лейкоцитами) вкНК могут связываться как с помощью ионных взаимодействий, так и с белками клеточной мембраны [25].
Остается открытым вопрос о происхождении внНК в крови онкологических больных. Причинами увеличения вкНК в крови являются апоптоз/некроз клеток опухоли [2; 25; 28]. Кроме того, высказано предположение о существовании механизма активного высвобождения вкНК опухолевыми клетками (активная метаболическая секреция) [28]. Согласно этому механизму вкДНК секретируется в комплексе с РНК и гликопротеинами. Наконец, определенный вклад в общий пул вкНК могут вносить и нейтрофильные внеклеточные ловушки, при образовании во внеклеточное пространство которых секретируется ДНК в комплексе с гистонами и ферментами, высвобождаемыми из гранул нейтрофилов [28]. М.Л. Филипенко (2017) считает, что механизмы высвобождения нуклеиновых кислот из клетки могут различаться для разных типов рака [28].
Изменение концентрации вкНК может также быть обусловлено за счет микровезикул, которые образуют опухолевые клетки. Циркулирующие микровезикулы выделены из крови больных некоторыми видами рака. Вполне вероятно участие микровезикул в межклеточной сигнализации между опухолевыми клетками и окружающей средой. Такие везикулы содержат рецепторы, белки, липиды, mRNA, microRNA. Rak J. использовал название «онкосома» для везикул, которые образуются опухолевыми клетками, и высказал предположение, что онкосомы могут содержать онкобелки и другие биологически активные молекулы, способные стимулировать прогрессирование опухоли, инвазию, ангиогенез и метастазы [29]. Высказана гипотеза, что microRNA, входящие в состав опухолевых микровезикул, подавляют иммунитет [25]. Кроме клеток опухолей, микровезикулы могут образовывать тромбоциты, клетки эндотелия и клетки воспалительного ответа. Циркулирующие микровезикулы рассматриваются как источник потенциальных биомаркеров для прогноза прогрессирования опухолей, ангиогенеза, тромбоза и ответа на таргетную терапию [30].
Следовательно, в настоящее время можно выделить следующие направления исследования вкНК. Одно направление связано с изучением количества циркулирующих нуклеиновых кислот в крови больных с различными видами опухолей. Причем проводится определение вкДНК или РНК не только в плазме или сыворотке крови, но и связанные с клетками крови. Большой интерес представляет исследование динамики изменения концентрации вкНК в процессе лечения, особенно при применении различных видов терапии и их комбинации.
Другое важное направление связано с использованием циркулирующих ДНК для жидкостной биопсии, что представляется весьма перспективным для ранней диагностики опухолевого процесса. Перспективность исследования связана с тем, что в отличие от ДНК, полученной из биоптата пораженного органа, исследование вкДНК дает информацию не только о генетическом профиле первичной опухоли, но и метастазов. В этом плане представляются перспективными исследования последних лет, посвященных исследованию эпигенетических модификаций циркулирующей ДНК, важность которых подчеркнута в работе М.Л. Филипенко (2017) [28]. Речь идет о программном разделении метилированной вкДНК по фракциям, которые соответствуют специализированным клеткам организма человека, что дает возможность определять патологически измененные клетки органа, которые избыточно синтезируют и секретируют специфичную вкДНК [28].
Наряду с изучением вкДНК проводятся интенсивные исследования циркулирующих microRNA. Учитывая то, что microRNA в биологических жидкостях являются достаточно стабильными, ведется разработка определения множественного профиля циркулирующих в крови microRNA в качестве диагностического инструмента. Весомым аргументом являются результаты Bertoli G. et al. [31], показавших информативность определения профилей циркулирующих microRNA для ранней диагностики (miR-9, miR-10b и miR-17-5p), прогноза (miR-148a и miR-335), а также прогнозирования результатов лечения (miR-30c, miR-187 и miR-339-5p) рака молочной железы. Не менее перспективным направлением является разработка новых лекарственных препаратов, основанных на microRNA.
Третье направление связано с исследованием молекулярных механизмов высвобождения вкНК, форм их существования и путей утилизации вкНК из крови онкологических больных, что обеспечит безусловный прогресс в изучении роли вкНК в патогенезе опухолевого процесса.
Библиографическая ссылка
Фоменко Ю.М., Жумакаева С.С., Жумакаева А.М., Сирота В.Б., Муравлёва Л.Е. ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ПРИ ОНКОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2018. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=27547 (дата обращения: 20.04.2024).