Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ IN VITRO ДЛЯ СОЗДАНИЯ КЛОНОВЫХ ЛЕСОСЕМЕННЫХ ПЛАНТАЦИЙ НА ПРИМЕРЕ ОЛЬХИ

Сиволапов В.А. 1 Чернодубов А.И. 1
1 ФГБОУ ВПО "Воронежская государственная лесотехническая академия"
Проведен анализ использования микроклонального размножения в создании клоновых лесосеменных плантаций (ЛСП) древесных растений на примере ольхи черной и серой. Изучен пыльцевой режим и плодоношение регенерантов in vitro и сеянцев на лесосеменной плантации ольхи в возрасте 10 лет. Средняя высота регенерантов составила 4,9 ± 0,37 – 5,6 ± 0,69 м, средний диаметр 4,7 ± 0,76 – 5,3 ± 0,73 см. Средняя высота сеянцев 4,9 ± 0,35 м, средний диаметр 5,2 ± 0,68 – 5,4 ± 0,81 см. Цветение клонов начинается на 3–4 год. Цветение сеянцев наступает с 3–6 лет. Жизнеспособность свежесобранной пыльцы ольхи черной и серой составляет 95 – 98 %. Длина шишек у сеянцев составила в среднем от 1,6±0,03 до 1,8±0,06 см, у регенерантов – от 1,4±0,04 до 1,7±0,04 см. Лабораторная всхожесть семян, полученных от регенерантов и сеянцев, не отличается и составляет 85 %. Показана возможность использования биотехнологии in vitro при создании ЛСП, в случае трудности прививок.
клоновые лесосеменные плантации
ольха черная
ольха серая
биотехнология in vitro
1. Благодарова Т. А. Селекция ольхи черной (Alnus glutinosa (L)Gaertn.) для разведения в Центрально-Черноземном районе: автореф. дис… канд. с.-х. наук. – Воронеж, 1995. – 19 с.
2. Давидов М. В. Особенности роста черноольховых насаждений / М. В. Давыдов // Лесное хозяйство. – 1976. – № 8. – С. 43 – 45.
3. Ефимов Ю. П. Генетико-селекционные основы лесного семеноводства [Электронный ресурс] / Ю. П. Ефимов // Х юбилейный международный лесной форум: Международная научно-практическая конференция «Роль леса в стабилизации климата: Исследования-Инновации-Инвестиции-Кадровый потенциал», 3 – 7 окт. 2008 г. – СПб.: В. К. Ленэкспо. – 16 с.
4. Ефимов Ю. П. Семенные плантации в селекции и семеноводстве сосны обыкновенной / Ю. П. Ефимов. – Воронеж: Изд-во «Истоки», 2010. – 253 с.
5. Исаков И. Ю. Влияние способа опыления на селекционные особенности семенного потомства Betula pendula Roth. и B. Pubescens Ehrh: автореферат канд… с.-х. наук. – Воронеж, 2001. – 19 с.
6. Лесной кодекс Российской Федерации. Комментарии: изд. 2-е, доп. / под общ. ред. Н. В. Комаровой, В. П. Рощупкина. – М.: ВНИИЛМ, 2007. – 856 с.
7. Указания по лесному семеноводству в Российской Федерации. – М.: Рослесхоз. 2000. – 198 с.
8. Сиволапов А. И. Селекция и семеноводство древесных растений: уч. пособие / А. И. Сиволапов. – Воронеж: ВГЛТА, 2011. – 204 с.
9. Danell О. Survey of past, current and future Swedish forest tree breeding/ Danell О. [Pap] Joint. Meet. IUFRO Work. Part. S.2. 04-02 and S.2.02-16, Tuusula, Sept. 1991 // Silva fenn. – 1991. – 25. – № 4. – P. 241-247.

Введение

Современные вопросы лесовозобновления и лесоразведения должны выполняться на генетико-селекционной основе [9, 4, 6 и др.]. Селекционными методами можно значительно повысить продуктивность и качество насаждений, повысить устойчивость лесных культур.

Практически во всех странах мира, отмечает Ю. П. Ефимов [4], основной формой организации семеноводства признаны лесосеменные плантации (ЛСП), создаваемые путем размножения отобранных в насаждениях плюсовых деревьев.

Согласно «Указаниям по лесному семеноводству в РФ» [7] постоянную лесосеменную базу составляют ЛСП, созданные из клонов или семей плюсовых и элитных деревьев, постоянные лесосеменные участки (ПЛСУ), плюсовые деревья, архивы клонов, географические и испытательные культуры. Лесосеменные плантации – специально создаваемые насаждения, предназначенные для массового получения в течение длительного времени ценных по наследственным свойствам семян лесных растений. При выборе способа закладки многие лесоводы-селекционеры отдавали предпочтение ЛСП вегетативного происхождения, т.к. у потомства в полной мере сохраняются наследственные свойства плюсовых деревьев [8]. При создании прививочных плантаций применяют разные способы прививки [4 и др.]. Однако для таких  древесных пород, как ольха, приживаемость и сохранность прививок низкая [1 и др.]. Поэтому метод микроклонального размножения in vitro имеет большую перспективу.

Материал и методика

Материалом исследований были регенеранты in vitro и сеянцы ольхи черной (Alnus glutinosa (L.) Gaertn.) и ольхи серой (Alnus incana (L.) Moench.). У регенерантов и сеянцев проведены дендрометрические исследования их высоты, диаметра, ширины кроны, размеров шишек. Жизнеспособность пыльцы определяли методом окрашивания йод-хлоралгидратом [8]. Реактив готовится за 2 – 3 суток: 5 г  хлоралгидрата смешивают с 2 мл дистиллированной воды, добавляют кристаллический йод – 0,2 г, настаивают. Этот метод основан на йодной реакции: обычно жизнеспособные пыльцевые зерна полностью заполнены крахмалом. Размеры пыльцы выполнены окуляр-микрометром на микроскопе МБИ-6, микрофотографии – на микроскопе Биолам Р – 15.

Результаты исследования и обсуждение

В Новоусманском лесхозе Воронежской области заложен опытный участок  из регенерантов in vitro ольхи черной и серой. Опыт представляет интерес  по изучению возможности использования последних как посадочный материал для лесосеменных плантаций и лесных культур. В опыте представлены регенеранты 2 типов культуры: культура стеблевых узлов с 1 почкой и каллусная культура. В условиях теплицы регенеранты доращивались до возраста 1 и 2 лет. В условия опыта регенеранты высажены весной 2002 года. При сравнении роста регенерантов в опыте с закрытой и открытой корневой системой достоверно лучший рост отмечен в первом случае (tф=2,75>tст.=2,04). Регенеранты, высаженные в возрасте 1 год,  догнали по росту в высоту 2-летние. В  3 года отмечался вторичный рост по всем вариантам опыта и ухудшение общего состояния. Культуры из сеянцев превосходили регенеранты на 0,2 – 0,6 м.

В 2010 году проведено обследование плантации ольхи черной и серой, созданной сеянцами и регенерантами in vitro.

Анализ роста клонов и сеянцев показал, что различия между регенерантами  и сеянцами были не существенными на 5 % уровне значимости. Средняя высота регенерантов составила 4,9±0,37  –  5,6±0,69 м., средний диаметр 4,7±0,76 – 5,3±0,73 см. Средняя высота сеянцев 4,9±0,35 м, средний диаметр 5,2±0,68 – 5,4±0,81 см. Уровень изменчивости по высоте у регенерантов был средним – 19 %, повышенным – 25 – 27 % и высоким 32 %. Уровень изменчивости по диаметру был очень высоким.

Генеративное развитие деревьев ольхи семенного происхождения и регенерантов in vitro различается. Ольха черная начинает цвести и плодоносить в культурах с 3–6 лет, значительной семенной продуктивности она достигает лишь в 15–20 летнем возрасте [1, 2 и др.]. При микроклональном размножении деревьев ольхи черной они начинают цветение уже на 3–4 год. Нами приводятся сравнительные данные генеративного развития клонированных растений и сеянцев ольхи. Основные лесообразующие породы, в том числе ольха относятся к перекрестно опыляемым растениям, хотя некоторые биотипы дают качественные семена и при самоопылении [1, 4]. Известно, что урожай и качество семян у древесных пород определяются условиями опыления, то есть количеством, составом и качеством пыльцы в период цветения. Мужские цветки собраны в соцветия – густоцветковые сережки. Рано весной (когда тает снег), сережки вытягиваются, и пыльца высыпается.

Известно несколько методов определения жизнеспособности пыльцы в лабораторных условиях [4, 8 и др.]: проращивание пыльцы на жидких средах, твердых средах и экспресс-методы (реакция красителей на жизненно важные ферменты и другие вещества пыльцы). Нами использовался быстрый метод окрашивания пыльцы йод-хлоралгидратом, обычно жизнеспособные пыльцевые зерна полностью заполнены крахмалом. Если пыльцевые зерна полностью окрашиваются реактивом в виде фиолетовых зерен, то пыльца считается жизнеспособной. Половину частично окрашенных зерен относят к жизнеспособным, остальные к нежизнеспособным (рисунок 1). Определение жизнеспособности свежесобранной пыльцы проведено сразу после сбора методом окрашивания йод-хлоралгидратом (таблица 1).

Таблица 1. Жизнеспособность пыльцы регенерантов и сеянцев ольхи черной и серой

Название дерева

Количество окрашенных пыльцевых зерен, %

3.04.2011 г.

25.05.2011 г.

Ольха черная № 46 (сеянцы)

98

79

Ольха черная № 46 (in vitro)

97

74

Ольха черная № 3 (in vitro)

98

81

Ольха серая № 6 (сеянцы)

95

83

Ольха серая № 6 (in vitro)

96

87

При определении жизнеспособности пыльцы экспресс-методом установлено, что жизнеспособность пыльцы сеянцев ольхи черной и серой не отличается от микроклонированных растений. Жизнеспособность пыльцы ухудшается через два месяца на 15 – 20 %, то есть пыльцу можно хранить до двух месяцев. Хранение пыльцы проведено в пробирках в сухом прохладном, темном месте (на дне холодильника).

а) б)

в) г)

Рисунок 1. Пыльцевые зерна ольхи: а) ольха черная сеянцы; б) ольха черная, регенеранты in vitro; в) ольха серая, сеянцы; г) ольха серая, регенеранты  in vitro

Качественный и количественный состав формирующейся пыльцы в значительной степени определяется динамикой и характером поведения хромосом в мейозе при микроспорогенезе. Известно также, что между размерами пыльцевых зерен и плоидностью существует прямая зависимость. Исходя из этого, по такому морфометрическому показателю, как диаметр пыльцы, можно опосредованно судить об особенностях развития мужского гаметофита исследуемых организмов, об их генетической природе, в частности, о возможной гибридной, мутагенной или полиплоидной природе. Этот показатель важен для перекрестного опыления на лесосеменных плантациях.

Морфометрические показатели качественного состава пыльцы представлены в таблице  2.

Таблица 2. Диаметр пыльцевых зерен у исследуемых деревьев ольхи черной и серой

 

№ дерева

Диаметр пыльцы (мкмм), количество пыльцевых зерен,  %

 

21,7-24,8

 

27,9-31,0

 

 

< 31,0

 

деформи-рованная пыльца

Ольха черная № 46, сеянец

56

41

-

3

Ольха черная, регенерант от № 46

16

60

22

2

Ольха черная, регенерант от № 3

15

61

23

1

Ольха серая  № 6, сеянец

48

52

-

-

Ольха серая, регенерант от № 6

8

36

52

4

Анализ завершающего этапа формирования микроспор показал, что у регенерантов и сеянцев ольхи черной и серой процесс развития мужской генеративной сферы протекает без значительных отклонений и заканчивается образованием качественной, выравненной пыльцы. У регенеранта ольхи черной № 46 и черной № 3 наряду с нормальными выявлены и аномальные пыльцевые зерна, вероятно, гиперанеуплоиды с повышенным числом хромосом микроспоры. Обнаруженные мелкие пыльцевые зерна являются, вероятно, гипоанеуплоидными. Полученные данные на пяти деревьях свидетельствуют о том, что  пыльца регенерантов ольхи черной достоверно (на 5 % уровне значимости) крупнее, чем у сеянцев, и соответственно равны 28,3 ± 0,41 и 25,5 ± 0,48. Различия размеров пыльцы регенерантов in vitro и сеянцев существенны на 5 % уровне (tфакт. = 5,57 > t0.05 = 2,06).

Характеристика количественных показателей у шишек показала, что по коэффициенту формы шишек различия у них были не существенными (рисунок 2).

Рисунок 2. Обильное плодоношение регенерантов ольхи черной

Коэффициент формы шишек (отношение ширины к длине шишек) составил в среднем 0,50 – 0,64. Длина шишек у сеянцев составила в среднем от 1,6±0,03 до 1,8±0,06 см, у регенерантов – от 1,4±0,04 до 1,7±0,04 см. Различия по длине шишек достоверны на 95 % уровне значимости. Ширина шишек у сеянцев составила 0,9±0,03, у регенерантов от 0,8±0,04 до 0,9±0,02 см. Различия по ширине шишек у сеянцев и регенерантов отсутствуют. Лабораторная всхожесть семян, полученных от регенерантов и сеянцев, не отличается и составляет 85 %.

Заключение

Таким образом, первые опыты использования регенерантов in vitro ольхи для создания клоновых лесосеменных плантаций и культур этой породы представляют огромный интерес в селекционно-семеноводческой и лесокультурной практике. Изучение качественных и количественных характеристик пыльцы, шишечек и семян деревьев-регенерантов показало перспективность микроклонального метода при создании клоновых лесосеменных плантаций.

Рецензенты:

Панков Я. В., д.с.-х.н., профессор кафедры лесных культур, селекции и лесомелиорации ФГБОУ ВПО "Воронежская государственная лесотехническая академия", г. Воронеж.

Ефимов Ю. П., д.с.-х.н., профессор, главный научный сотрудник ФГУПНШ лесной генетики и селекции, г. Воронеж.


Библиографическая ссылка

Сиволапов В.А., Чернодубов А.И. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ IN VITRO ДЛЯ СОЗДАНИЯ КЛОНОВЫХ ЛЕСОСЕМЕННЫХ ПЛАНТАЦИЙ НА ПРИМЕРЕ ОЛЬХИ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=7623 (дата обращения: 23.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074