Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Арчинова Т.Ю. 1 Манджиголадзе Т.Ю. 1

---

1 Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУМинздрава России

Изучен состав лецитина очищенного из яичных желтков. Результаты идентификации лецитина методом ТСХ показали наличие в нем фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, лизофосфатидилхолина. Кроме метода ТСХ для идентификации фосфолипидов использовали химические реакции гидролиза, окисления, соле- и комплексообразования, присоединения, осаждения на функциональные группы, такие как: четвертичное аммониевое основание, сложноэфирную группу, остаток глицерина, жирные кислоты (после гидролиза), остаток фосфорной кислоты. Нами были установлены некоторые физические константы: йодное число, кислотное число, рН, потеря в массе при высушивании, зольный остаток, тяжелые металлы, плотность с использованием фармакопейных методов. Предварительные исследования показали, что оптимальным методом количественного определения фосфолипидов в полученном яичном лецитине является гравиметрия. Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый лецитин по количественному содержанию фосфора (3,8 %) соответствует требованиям ФС, которого должно быть не менее 3,5 %. Валидационная оценка методики количественного гравиметрического определения фосфора в яичном лецитине по критериям «Прецизионность», «Сходимость», «Число параллельных определений» показала ее пригодность для аналитических целей.

Статья в формате PDF

149 KB

валидационная оценка

ТСХ

гравиметрия

фосфолипиды

яичный лецитин

1. Государственная фармакопея Российской федерации. – 12-е изд. – М.: «Изд-во «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008. – Ч. 1, 2.

2. Манджиголадзе Т. Ю., Арчинова Т. Ю. Изучение гепатопротекторного действия лецитина и сиропа с лецитином //Актуальные проблемы науки фармац. и мед.вузов: от разработки до коммерциализации: материалы науч. практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Пермской ГФА 7–9 дек. 2011 г. – Пермь, 2011. – С.115-118.

3. Патент РФ 2002100678 / 13, 03.01.2002. Оганесян Э. Т., Мальцев Ю. А., Магонов М. М., Воробьев Н. Ю. Способ получения яичного лецитина // Патент России № 2255559.2002.

4. Прохорова Л. В., Шемстова В. В., Антонова Н. П. Применение хроматографических методов (ТСХ, ГЖХ, ВЭЖХ) в анализе фосфолипидов (обзор) // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы съезда 22–25 июня 2005 г. – СПб., 2005. – С. 549-556.

5. Скатков С. А. Влияние фосфолипидов на фертильность // Проблемы репродукции. – 2002. – № 3. – С. 20-25.

6. ФС 42-2119-91. «Лецитин очищенный». – 6 с.

Введение

Актуальной проблемой современной медицины является лечение и профилактика заболеваний печени. Строительным материалом клеток органа служат фосфолипиды, которые обладают гепатопротекторным эффектом, одновременно являясь детоксикантами и антицирротическими факторами [2].

Фосфатидилхолин, известный так же, как лецитин, является наиболее важным питательным веществом для поддержания активного состояния печени, а также универсальным строительным блоком для клеточных мембран и обладает антисклеротическим, нейропротекторным и гиполипидемическим действием, предотвращает образование желчных камней. Фосфолипиды, содержащиеся в лецитине, способствуют поддерживанию гомеостаза липидов в организме человека, а также препятствуют замещению печеночных клеток на холестазу [5].

Цель исследования

Известно, что лецитин в достаточных количествах содержится в клетках куриных яиц, поэтому целью настоящих исследований явилось изучение состава лецитина очищенного из яичных желтков, а также разработка оптимальных методик идентификации и количественного определения фосфолипидов, входящих в состав лецитина.

Материал и методы исследования

Объектом исследования является яичный лецитин, полученный на кафедре органической химии профессором Э. Т. Оганесяном и к. ф. н. М. М. Магоновым по модифицированной методике, отличающейся от прототипа тем, что в нем, во-первых, исключено применение солей кадмия; во-вторых, экстракция проводится индивидуальными малотоксичными растворителями (этиловый спирт, ацетон); технологическая схема реализуется на стандартном оборудовании с учетом требований к качеству, регламентируемому соответствующими НД [3].

Методы: химические (качественные реакции), гравиметрия, физико-химические (ТСХ).

Результаты исследования и их обсуждение

Суть методики получения лецитина из яичных желтков заключается в предварительной экстракции лецитина при низких температурах (-18–20 0С) ацетоном. Полученный экстракт подвергают многократной очистке поочередно этанолом и ацетоном. После удаления растворителей и упаривания готовый продукт представляет собой однородную массу плотной гелеобразной консистенции желтого цвета, легко растворимую в этаноле, хлороформе, умеренно – в жирных маслах и практически нерастворимую в воде очищенной и ацетоне.

Полученный лецитин неустойчив к воздействию света и высокой температуры.

С целью изучения состава полученного лецитина использовали метод ТСХ. Предварительно был проведен поиск оптимальной системы растворителей (подвижной фазы). Оказалось, что из 20 систем наиболее приемлемыми явились:

I) хлороформ – метанол (39:15);

II) хлороформ – этанол (39:15);

III) n-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:5);

IV) хлороформ – ацетон – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (5:2:1:1:0,2).

Разделение предполагаемых фосфолипидов в лецитине проводили на пластинках марки «Сорбфил – УФ-254», нанося на линию старта 0,05 мкл 1 % хлороформного раствора изучаемого образца. При проявлении в парах йода проявляются семь пятен.

Результаты идентификации лецитина методом ТСХ представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты идентификации лецитина методом ТСХ (проявитель – пары йода)

Три пятна были идентифицированы, остальные («4»-«7») – нет, из-за отсутствия свидетелей.

Более четкого разделения веществ удалось добиться при использовании системы растворителей: хлороформ-этанол (39:5) (рис. 1).

Рисунок 1. Хроматограмма лецитина в системе растворителей:

хлороформ-этанол (39:5)

Свидетели: II – Фосфатидилхолин

III – Фосфатидилэтаноламин

IV – Лизофосфатидилхолин

Полученные результаты позволяют предположить, что оптимальной подвижной фазой является система II, а также согласуются с литературными данными [4].

Кроме метода ТСХ для подтверждения подлинности фосфолипидов лецитина использовали химические реакции на функциональные группы и структурные элементы. Для анализа брали 5 % спиртовой раствор исследуемого лецитина.

Третичный амин и четвертичное аммониевое основание обнаруживали по появлению осадков после добавления раствора кадмия хлорида.

Сложноэфирную группу идентифицировали с помощью реакции образования гидроксамата железа (III) (красно-бурый осадок).

Остаток глицерина после щелочного гидролиза фосфолипидов и удаления выпавших в осадок жирных кислот из кислой среды обнаруживали с помощью реакции образования комплексной медной соли в аммиачной среде (синее окрашивание).

Остаток кислоты фосфорной после гидролиза идентифицировали реакцией взаимодействия саммония молибдатом в азотнокислой среде (желтый осадок).

Наличие холина подтверждали при нагревании гидролизата. Ощущался характерный запах триметиламина, который окрашивал смоченную водой очищенной красную лакмусовую бумагу в синий цвет.

Продукты окисления лецитина идентифицировали с помощью реактива Марки; на границе двух слоев жидкости появлялось красное окрашивание.

Сумму фосфолипидов также идентифицировали по стойкой водной эмульсии, а фосфатидилхолин – с помощью реакции осаждения ацетоном.

Кроме того, были установлены некоторые физические константы (табл. 2) с использованием фармакопейных методов для установления доброкачественности полученного лецитина [1].

Таблица 2. Некоторые числовые показатели яичного лецитина

Результаты, представленные в таблице 2, соответствуют требованиям ФС [6].

Предварительные исследования по поиску оптимального метода количественного определения лецитина с использованием титриметрических методов (неводное титрование, аргентометрия, нейтрализация в спиртовой среде) не дает достоверных и воспроизводимых результатов. Это объясняется тем, что лецитин – это комплекс фосфолипидов, и рассчитать правильный титр не представляется возможным. Поэтому оптимальным методом количественного определения фосфолипидов в полученном яичном лецитине является гравиметрия, основанная на минерализации лецитина до магния пирофосфата.

Методика. Около 1 г лецитина (точная навеска) помещают в колбу для определения азота вместимостью 500 мл, прибавляют 20 мл кислоты серной концентрированной и 3 мл кислоты азотной концентрированной. Смесь осторожно нагревают на сетке, на небольшом пламени до обесцвечивания раствора; для ускорения сгорания органического вещества к охлажденной смеси дополнительно прибавляют несколько раз малыми порциями кислоту азотную.

Остывший бесцветный раствор переносят в стакан, нейтрализуют концентрированным раствором аммиака (по метиловому красному), прибавляют несколько капель кислоты хлористоводородной, разведенной до кислой реакции, 10мл раствора аммония хлорида и нагревают раствор до 60 °С. К теплому раствору прибавляют 25 мл раствора смеси, состоящей из магния сульфата, аммония гидроксида, аммония хлорида и при постоянном помешивании 2,5 % раствора аммиака. Через 30 минут добавляют 20 мл концентрированного раствора аммиака и оставляют до полного осаждения. Через 12 часов смесь фильтруют через беззольный фильтр, осадок на фильтре промывают 8–10 раз 2,5 % раствором аммиака, фильтр осторожно сжигают, остаток прокаливают и взвешивают. Опыт повторяют трижды.

Содержание фосфора (X) в % рассчитывают по формуле:

Х%=а∙100%∙0,2783, (1)

где а – остаток после прокаливания (магния пирофосфат), г;

0,2783 – коэффициент пересчета на фосфор.

Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты количественного определения фосфора в лецитине гравиметрическим методом

Полученные данные свидетельствуют о том, что исследуемый лецитин по количественному содержанию фосфора соответствует требованиям ФС, которого должно быть не менее 3,5 %.

С целью установления пригодности для аналитических целей разработанной методики гравиметрического определения фосфолипидов в яичном лецитине была проведена ее валидационная оценка по критериям: «Прецизионность», «Сходимость результатов определений» (статистика однородности выборки), «Число параллельных определений».

Фактор сходимости результатов двух параллельных определений L (P, n) при P=95 % иn=2, равен 2,77. В случае сходимости должно реализовываться неравенство:

|-|<L·S, (2)

где L – фактор, используемый при оценке сходимости результатов параллельных определений;

S – стандартное отклонение;

тогда:

L∙S=2,77∙0,026=0,07

а) |8,82-8,85|=0,03

б) |882-8,8|=0,02

Как видно из результатов 0,03<0,07 и 0,02<0,07.

Таким образом, результаты сходимы.

Число параллельных определений рассчитывается по формуле:

m=, (3)

где ∆Х – полуширина доверительного интервала величины;

εα–относительная ошибка результата отдельного определения;

– среднее значение в %, равное 3,82 %.

m==1,00

Достаточно одного определения, так как ошибка при гравиметрическом определении (φ) равна 1 %.

Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты валидационной оценки количественного гравиметрического определения фосфора в лецитине очищенном

Валидационная оценка методики количественного гравиметрического определения фосфора в яичном лецитине по критериям «Прецизионность», «Сходимость результатов определений», «Число параллельных определений» показала ее пригодность для аналитических целей.

Выводы

1. Изучен состав полученного лецитина с помощью метода ТСХ. Обнаружены: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и лизофосфатидилхолин.

2. Разработаны методики идентификации входящих в лецитин фосфолипидов по функциональным группам.

3. Проведено количественное определение фосфолипидов по содержанию фосфора гравиметрическим методом.

4. С помощью валидационной оценки подтверждена пригодность методики количественного определения фосфора в яичном лецитине для аналитических целей.

Рецензенты:

Лазарян Джон Седракович, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой токсикологической химии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ РФ, г. Пятигорск.

Попова Ольга Ивановна, доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ МЗ РФ, г. Пятигорск.

Библиографическая ссылка