Введение
Одной из актуальных задач современной фармации является проведение исследований по совершенствованию стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) [2-6]. Это объясняется, с одной стороны, сложным химическим составом ЛРС, а с другой - в некоторых случаях недостаточной степенью изученности его химического состава. Одним из представителей видов ЛРС, в случае которых вопросы стандартизации решены не в полной мере, являются цветки пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.).
В соответствии с Государственной Фармакопеей СССР XI издания (ст. 11) количественное определение суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот осуществляют методом прямой спектрофотометрии буферного раствора упаренного спиртового извлечения цветков пижмы обыкновенной при длине волны 310 нм [1]. Обсуждаемая методика количественного определения достаточно длительна, трудоемка и требует работы с токсичным растворителем (дихлорэтан), а выбранная аналитическая длина волны не соответствует спектральным характеристикам анализируемых веществ. Кроме того, в данной фармакопейной статье отсутствует раздел «Качественные реакции», что не соответствует современным тенденциям в области фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья.
На наш взгляд, несмотря на сложный химический состав цветков пижмы обыкновенной, представленный такими группами биологически активных соединений (БАС), как эфирное масло, флавоноиды, гидроксикоричные кислоты, стандартизацию сырья данного растения целесообразно осуществлять по флавоноидам. Именно флавоноиды в первую очередь обусловливают желчегонные и гепатопротекторные свойства препаратов пижмы обыкновенной [3; 7]. По разным литературным источникам [5; 7], флавоноиды цветков пижмы обыкновенной в основном представлены апигенином (5,7,41-тригидроксифлавон), лютеолином (5,7,31,41-тетрагидроксифлавон), цинарозидом (7-О-b-D-глюкопиранозид 5,7,31,41-тетрагидроксифлавона), эупатилином (5,7- дигидрокси-6,31,41-триметоксифлавон), яцеидином (5,7,41-тригидрокси-3,6,31-триметоксифлавон), яцеозидином (5,7,41-тригидрокси-6,31-диметоксифлавон).
С целью обоснования методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов пижмы обыкновенной из цветков данного растения с использованием колоночной хроматографии ранее нами были выделены апигенин (5,7,41-тригидроксифлавон) (1), акацетин (5,7-дигидрокси-41-метококсифлавон) (2), 7-О-β-О-глюкопиранозид апигенина (космосиин) (3) и тилианин (7-О-β-D-глюкопиранозид акацетина) (4) [4].
Апигенин (1)
Акацетин (2)
Космосиин (3)
Тилианин (4)
Рис. 1. Химические структуры важнейших флавоноидов цветков пижмы обыкновенной.
На основе результатов изучения компонентного состава флавоноидов цветков пижмы обыкновенной разработана методика количественного определения суммы флавоноидов с использованием дифференциальной спектрофотометрии и Государственного стандартного образца цинарозида [3]. В плане дальнейшего совершенствования методов стандартизации ЛРС, в том числе цветков пижмы обыкновенной, особый интерес представляют такие методы, как тонкослойная хроматография (ТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [2; 5; 8; 9].
Цель исследования – научное обоснование новых подходов к стандартизации цветков пижмы обыкновенной.
Материал и методы исследования
В качестве объектов исследования взяты образцы цветков пижмы обыкновенной, собранные в Самарской области (июль 2011 и 2012 гг.), а также промышленные образцы сырья ОАО «Красногорсклексредства» – сырье измельченное (пачки, 50 г).
В работе использованы тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография и спектрофотомерия. Регистрацию УФ-спектров проводили с помощью спектрофотометра Specord 40 (Analytik Jena). Воздушно-сухое растительное сырье подвергали исчерпывающему экстрагированию 70%-ным этиловым спиртом в соотношении «сырье – экстрагент» - 1:50. Анализ полученных водно-спиртовых извлечений осуществляли с помощью ТСХ на пластинках «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» в системе хлороформ-этанол-вода (26:16:3). При этом в качестве стандартных веществ использовали апигенин (1), акацетин (2), космосиин (3) и тилианин (4).
Исследование водно-спиртовых извлечений из цветков пижмы обыкновенной с помощью ВЭЖХ осуществляли с использованием хроматографа «Стайер» (ООО «НПО Аквилон», г. Подольск) и колонки размером 4,6 х 250 мм (стационарная фаза - октадецил силан С-18), объем вводимой пробы – 25 мкл. В качестве подвижной фазы использовали смеси «ацетонитрил-вода» в соотношении (40:60). Скорость подачи элюента составила 2 мл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длине волны 270 нм. В качестве подвижной фазы использовали смеси «ацетонитрил-вода» в соотношении 40:60. Скорость подачи элюента составила 2 мл/мин. Детектирование веществ осуществляли УФ-детектором при длине волны 270 нм. Качественный анализ проводили посредством регистрации времен удерживания веществ и сравнения спектральных отношений, причем как в условиях метода внутреннего стандарта, так и путем введения растворов индивидуальных веществ в хроматографическую колонку. Количественный анализ осуществляли с использованием стандартного образца тилианина (4), выделенного нами ранее из цветков пижмы обыкновенной методом колоночной хроматографии [4]. Приготовление раствора стандартного образца тилианина осуществляли следующим образом: около 0,02 г (точная навеска) тилианина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15-20 мл 96%-ного этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 95%-ным этиловым спиртом до метки.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты ТСХ-анализа свидетельствуют о том, что доминирующим флавоноидом цветков пижмы обыкновенной является тилианин (3) (рис. 2). Кроме того, обнаруживаются такие флавоноиды, как апигенин (1), акацетин (2) и космосиин (3). Наряду с флавоноидами на хроматограмме извлечения обнаруживаются еще два компонента (рис. 2) – соединение с величиной Rf около 0,8, соединение с величиной Rf около 0,15, полученные методом препаративной ТСХ и, по предварительным данным, отнесенные нами к фенилпропаноидам по характеру флуоресценции и характерным максимумам поглощения в УФ-спектре. При этом следует отметить, что соединение с величиной Rf около 0,15, являясь по характеру кривой поглощения производным кофейной кислоты, в значительной мере определяет кривую поглощения раствора водно-спиртового извлечения из цветков пижмы обыкновенной (рис. 3). Что касается доминирующего флавоноида – тилианина, то и это соединение, имея максимумы поглощения при 270 и 327 нм, также вносит вклад в оптическую плотность, особенно с точки зрения определения суммы флавоноидов с использованием разработанной нами методики количественного определения суммы флавоноидов [6].
Учитывая то обстоятельство, что доминирующий флавоноид тилианин (4) имеет диагностическое значение, на наш взгляд, ТСХ-анализ может быть использован для целей идентификации сырья и препаратов данного растения. Кроме того, для определения подлинности цветков пижмы обыкновенной могут также быть использованы спектральные характеристики водно-спиртового извлечения из сырья данного растения.
Рис. 2. Схема тонкослойной хроматограммы веществ и водно-спиртового извлечения из цветков пижмы обыкновенной (система растворителей: хлороформ – этанол – вода, 26:16:3).
Обозначения: 1 – водно-спиртовое извлечение из сырья;
2 – акацетин (2);
3 – апигенин (1);
4 – соединение фенилпропаноидной природы;
5 – тилианин (4);
6 – космосиин (3).
Рис. 3. Электронный спектр водно-спиртового извлечения из цветков пижмы обыкновенной.
В последнее время для целей стандартизации активно внедряется метод ВЭЖХ, позволяющий одновременно осуществлять качественный и количественный анализ ЛРС. На наш взгляд, в условиях ВЭЖХ в качестве маркера может выступать доминирующий флавоноид тилианин (4). ВЭЖХ-анализ показал, что тилианин, имея время удерживания на хроматограммах около 5 мин (рис. 4 и 5), четко отделяется от других компонентов, что позволяет данный метод рекомендовать как для целей идентификации цветков пижмы обыкновенной, так и для количественной оценки содержания данного диагностического компонента.
Рис. 4. ВЭЖХ-хроматограмма водно-спиртового извлечения из цветков пижмы обыкновенной.
Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в исследуемых условиях хроматографирования тилианин (4) с величиной времени удерживания около 5 мин хорошо отделяется от других компонентов цветков пижмы обыкновенной (рис. 4 и 5).
Рис. 5. ВЭЖХ-хроматограмма спиртового раствора тилианина.
Содержание тилианина в абсолютно сухом сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
S х mо х V x V1 х 100 х 100
Х = --------------------------------------,
Sо х m х Vо х V2 х (100-W)
где S – среднее значение высоты пика тилианина испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца, mAU*сек;
Sо - среднее значение высоты пика раствора СО тилианина, вычисленное из хроматограмм раствора СО тилианина, mAU*сек;
V - объем испытуемого раствора, мл;
V1 - объем вводимой пробы испытуемого раствора, мкл;
Vо – объем раствора СО тилианина, мл;
V2 – объем вводимой пробы раствора СО тилианина, мкл;
m - масса навески сырья, г;
mо - масса СО тилианина, г;
С применением разработанной методики проанализирован ряд образцов сырья и показано, что содержание тилианина в цветках пижмы обыкновенной варьирует в пределах от 1,08 до 4,41%.
На наш взгляд, разработанный подход к стандартизации с использованием ВЭЖХ перспективен для анализа лекарственного препарата «Танацехол» на основе флавоноидов цветков пижмы.
Выводы
1. Разработаны новые подходы к стандартизации цветков пижмы обыкновенной, заключающиеся в комплексном использовании спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ.
2. С учетом специфичности тилианина для цветков пижмы обыкновенной является целесообразным использование методов ТСХ и ВЭЖХ для определения подлинности сырья и препаратов данного растения по обнаружению данного флавоноида, имеющего диагностическое значение.
2. Метод ВЭЖХ целесообразно использовать как для качественного анализа цветков пижмы обыкновенной, так и для количественного определения тилианина в сырье и препаратах данного растения.
Рецензенты:
Шаталаев Иван Федорович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой химии фармацевтического факультета Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара.
Правдивцева Ольга Евгеньевана, доктор фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Самара.
Библиографическая ссылка
Куркина А.В., Калабухова Е.А., Власова Г.И., Демидова Г.А., Авдеева Е.В. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ВЭЖХ ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ ЦВЕТКОВ ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (TANACETUM VULGARE L.) // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=10031 (дата обращения: 25.04.2024).