Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ ПОПУЛЯЦИЙ ЗАПАДНОЙ РАСЫ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ LARIX SIBIRICA LEDEB. (L. SUKACZEWII) НА СРЕДНЕМ И СЕВЕРНОМ УРАЛЕ

Нечаева Ю.С. 1 Жуланов А.А. 1 Красильников В.П. 1 Боронникова С.В. 1
1 ФГБОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
Дана характеристика генофондов девяти популяций западной расы лиственницы сибирской L. sibirica Среднего и Северного Урала на основании анализа полиморфизма двух типов молекулярных маркеров (ISSR и SNP). Обнаружено, что в совокупности изученные популяции характеризуются высоким уровнем генетического разнообразия: доля полиморфных локусов (Р95) составила 0,951, ожидаемая гетерозиготность (HE) в суммарной выборке – 0,202, а гаплотипическое разнообразие (Hd), определенное на основании полиморфизма SNP-маркеров – 0,896. Наибольшими значениями показателей генетического разнообразия характеризовались популяции Ls5 и Ls9, а наименьшими – Ls7. При оценке уникальности генофонда использовали коэффициент генетической оригинальности (КГО), анализ которого позволил выявить популяции с типичными и специфичными для региона генофондами. Для комплексной оценки состояния генофондов популяций все установленные показатели генетического разнообразия переведены в разработанную на примере изученных природных популяций L. sibirica шкалу оценки состояния генофондов. Установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды восьми изученных популяций, а в одной популяции (Ls7) отмечены признаки обеднения генофонда. Даны рекомендации по отбору популяций в качестве объектов сохранения генофондов L. sibirica на Среднем и Северном Урале.
полиморфизм ДНК
генетическое разнообразие
ISSR-маркеры
snp-маркеры
генофонд популяции
larix sibirica ledeb.
1. Боронникова С.В. Исследование генетической изменчивости популяций редкого вида Урала Adenophora lilifolia (L.) A.DC. на основании анализа полиморфизма ISSR-маркеров // Генетика. – 2009. – Т. 45, № 5. – С.652–655. (Boronnikova S.V. Genetic Variation in Ural Populations of the Rare Plant Species Adenophora lilifolia (L.) DC. inferred from ISSR-markers // Russian Journal of Genetics. – 2009. – Vol. 45, №5. – P. 573-576.
2. Боронникова С. В. Молекулярно-генетический анализ и оценка состояния генофондов ресурсных видов растений Пермского края: монография. – Пермь: Перм. гос. нац. исслед. ун-т, 2013. – 223 с.
3. Боронникова С.В. Популяционно–генетический мониторинг генофондов редких ресурсных видов растений Пермского края // Флора Урала в пределах бывшей Пермской губернии и ее охрана: материалы межрегиональной конференции, посвященной 140-летию со дня рождения П.В. Сюзева. – Пермь, 2007. – С. 37-43.
4. Животовский Л.А. Показатель внутрипопуляционного разнообразия // Журн. общ. биологии. – 1980. – Т. 41, № 6. – С. 828-836.
5. Нечаева Ю.С. Молекулярно-генетический анализ природных популяций западной расы Larix sibirica Ledeb. (Larix suckasczewii Dyl.) на Среднем и Северном Урале: автореф. дис. … канд. биол. наук. – Уфа, 2015. – 24 с.
6. Потокина Е. К., Александрова Т.Г. Методы классификации внутривидового разнообразия по результатам молекулярного маркирования // Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века: Материалы Всероссийской конф. – Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. – Ч. 3. – С. 62-65.
7. Путенихин В. П. Фенотипическая структура популяций дуба черешчатого в Башкирском Предуралье как основа сохранения генофонда вида в регионе // Изв. Самар. науч. центра РАН. – 2013. – Т.15, № 3 (4). – С. 1410-1412.
8. Светлакова Т.Н. Эколого-генетический анализ популяционной структуры Populus tremula L. в Пермском крае // Экологическая генетика. – 2012. – Вып.3. – С. 43-47.
9. Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. – 1985. – Vol. l, no. 19. – P. 69-76.
10. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. – 1994. – V.20. – P. 76–183.

Оценка современного состояния биологического разнообразия лесных фитоценозов и их ресурсов играет важную роль в формировании как фундаментальных основ изучения и сохранения растительных ресурсов, так и прикладных аспектов их рационального использования в хозяйственно-экономических интересах страны. На основе оценки характера изменчивости и популяционной структуры можно наметить общие пути сохранения генофонда вида в регионе на популяционной основе, отобрать локальные популяций для сохранения и воспроизводства вида. Однако популяционный подход остается наименее разработанным в области сохранения биоразнообразия растений [7]. Изучение генофондов ресурсных видов растений с использованием молекулярных маркеров ДНК основано на анализе количественных характеристик генетического разнообразия популяций [3]. Для характеристики генетического разнообразия гетерогенных природных популяций растений необходим молекулярно-генетический анализ их генофондов с использованием, как минимум, двух типов высоко полиморфных молекулярных маркеров [2]. Эти маркеры должны давать возможность анализа полиморфизма различных структурных элементов генома. Так, ISSR-маркеры выявляют полиморфизм участков ДНК, заключенных между тандемно повторяющимися элементами – микросателлитами [10], и приобрели большую популярность для изучения генетического разнообразия ресурсных травянистых [1] и древесных видов растений [8]. Другой тип молекулярных маркеров (SNP-маркеры) выявляют нуклеотидный полиморфизм в локусах структурных генов. В совокупности два типа молекулярных маркеров позволяют проанализировать большую часть генома изучаемого вида, дать разностороннюю характеристику изучаемых генофондов и выявить их специфические особенности. Большую актуальность приобретает изучение генофондов ресурсных видов растений, занимающих обширные ареалы и имеющих хозяйственное значение, таких как виды рода Larix Mill., которые являются самыми распространенными древесными видами растений России и играют большую водоохранную и почвозащитную роль, особенно в северных и горных лесах. На Урале род Larix представлен западной расой лиственницы сибирской или л. Сукачева (Larix sukaczewii Dyl.). В связи с этим изучение генофондов популяций L. sibirica Северного и Среднего Урала на основе анализа полиморфизма двух типов ДНК-маркеров и разработка методики оценки состояния генофондов этого вида являются актуальной задачей для сохранения популяций лесных древесных видов, продуктивных и устойчивых к действию различных факторов среды.

Таким образом, цель данного исследования – дать характеристику и оценку состояния генофондов популяций западной расы лиственницы сибирской Северного и Среднего Урала на основании анализа полиморфизма двух типов молекулярных маркеров.

Материал и методы исследования

В качестве объектов исследований избраны девять природных популяций западной расы лиственницы сибирской, произрастающих на Среднем и Северном Урале, восемь из которых располагаются в Пермском крае: в государственном заповеднике «Вишерский» (Ls1, Ls2), около г. Красновишерск (Ls3); в Чердынском (Ls4), в Гаинском (Ls5), в Добрянском (Ls7), в Суксунском (Ls8) районах, а также две популяции находятся в Свердловской области: вблизи г. Качканар (Ls6) и пос. Билимбай (Ls9).

Для проведения молекулярно-генетического анализа в каждой из популяций собрана хвоя – индивидуально с 28–30 деревьев. Для выделения ДНК использовали методику С. Роджерса [9] с небольшими модификациями. Для полимеразной цепной реакции ISSR-методом реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq-полимеразы; 2,5 мкл 10х буфера + MgCl2 («Силекс М», Россия); 25 пМ праймера («Синтол», Россия); 0,25 мM dNTP («Fermentas», Литва); 5 мкл ДНК. Амплификацию ДНК проводили по стандартной для ISSR-метода программе с пятью ISSR-праймерами: М3 – (AC)8CT, Х10 – (AGC)6C, Х11 – (AGC)6G, ISSR-8 – (GAG)6C, CR-215 – (CA)6GT. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1,7 % агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием. Фотографирование и определения длины фрагментов ДНК проводили с помощью системы гель-документации GelDoc и программы Quantity One («Bio-Rad», USA). Для выявления SNP-маркеров в геноме L. sibirica отобраны три локуса потенциально адаптивно-значимых генов: 4CL1-363, sSPcDFD040B03103-274, ABA-WDS, амплификацию и секвенирование последовательностей данных локусов проводили в соответствии с рекомендациями, приведенными в литературных источниках [5].

Компьютерный анализ полиморфизма ДНК проведен с помощью общепринятых компьютерных программ POPGENE 1.31 и специализированного макроса GenAlEx6 для MS-Excel с определением доли (Р95) полиморфных локусов, абсолютного (na) числа аллелей, эффективного (ne) числа аллелей, ожидаемой (HE) гетерозиготности, информационного (I) Индекса Шеннона. Для выявления структуры внутрипопуляционного разнообразия применяли показатели внутрипопуляционного разнообразия (μ) и доли редких морф (h) [4]. Редактирование секвенированных последовательностей проводили в программе Sequence Scannerv1.0, местоположение полиморфных позиций определяли посредством выравнивания послeдоватeльностeй в компьютерной программе BioEdit v7.2.5. В программе DNASP v5 были реконструированы гаплотипы и на основе сравнения их нуклеотидных последовательностей рассчитаны общее гаплотипическое разнообразие (Hd) и нуклеотидное разнообразие (π), оценивающее среднее число парных различий на сайт. Оценка состояния генофондов популяций проведена в соответствии с методикой С. В. Боронниковой [2]. Выявлeниe спeцифичeских особeнностeй гeнофондов было провeдeно по модифицированной для дикорастущих дрeвeсных видов растeний мeтодикe подсчeта коэффициeнта гeнeтичeской оригинальности – КГО [6].

Результаты и их обсуждение

ISSR-маркеры в зависимости от праймера у L. sibirica выявляли от 17 до 34 ISSR-маркеров и всего в девяти популяциях было детектировано 123 ISSR-маркера, из которых 117 были полиморфными, то есть в совокупности изученные популяции характеризуются высокой долей полиморфных локусов (Р95=0,951). В отдельных популяциях этот показатель варьировал в пределах от 0,741 в популяции Ls7 до 0,871 в популяции Ls9 (табл. 1). Другой из основных показателей генетической изменчивости – ожидаемая гетерозиготность (HE). Она в суммарной выборке составила 0,202. Этот показатель выше в популяции Ls9 (HE=0,246), а самое низкое его значение (HE=0,171) отмечено в популяции Ls7. Для анализа генетического разнообразия на популяционном уровне был применен индекс разнообразия Шеннона. Он также выявил наибольшее разнообразие в популяции Ls9 (I=0,369), а наименьшее (I=0,258) – в популяции Ls7 (табл. 1). В дополнение к показателям, полученным на основании полиморфизма ISSR-маркеров, проведена характеристика генетического разнообразия изученных популяций на основе анализа гаплотипического разнообразия трех локусов потенциально адаптивно-значимых генов L. sibirica. Наибольшим гаплотипическим разнообразием характеризуется популяция Ls9 (Hd=0,911), а самое низкое значение этого показателя (Hd=0,636) выявлено в популяции Ls8. (табл. 1).

Большое значение для характеристики генофондов имеют показатели внутрипопуляционного разнообразия, анализ которого с применением показателя μ установил, что из 9 изученных популяций большей равномерностью распределения частот аллелей характеризуются популяции Ls5 и Ls9 (μ=1,747 и 1,738 соответственно), а наименьшей (μ=1,626) – популяция Ls7 (табл. 2). Показатель доля редких морф (h) оценивает структуру внутрипопуляционного разнообразия. По мнению Л. А. Животовского (1980), чем меньше значения h порогового 0.3, тем более сбалансированной структурой разнообразия характеризуются популяции. У всех изученных популяций показатель h имеет значения меньше 0,3 (табл. 1), наиболее сбалансированной структурой разнообразия характеризуется популяция Ls5 (h = 0,113), а наименее (h=0,187) популяция Ls7 (табл. 1). Для сравнения данных о внутрипопуляционном разнообразии, полученных с помощью двух типов ДНК-маркеров, проведен расчет показателя h на основании полиморфизма локуса 4CL1-363. В качестве морф рассматривалось число гаплотипов в популяции. В результате получены аналогичные ISSR-маркерам закономерности в распределении и структуре внутрипопуляционного разнообразия изученных популяций L. sibirica. Наиболее сбалансированной структурой нуклеотидного разнообразия характеризуются популяции Ls5 и Ls2 (h=0,078 и 0,075 соответственно), а наименее сбалансированной по данному типу маркеров (h=0,258) оказалась популяция Ls8 (табл. 1).

Для характеристики своеобразия генофондов большое значение имеет число уникальных аллелей (Un). Уникальные аллели, присутствующие только в одной из популяций и встречающиеся с заметной частотой (более 1 %) характеризуют уникальность генофонда на популяционном уровне. С использованием ISSR-метода анализа полиморфизма ДНК в популяциях Ls3, Ls5, Ls9 выявлено по одному уникальному, а в популяции Ls6 – 2 уникальных ISSR-маркера. Информативными для выявления уникальных аллелей были и SNP-маркеры. Уникальные SNPs обнаружены в восьми популяциях L. sibirica: в популяции Ls3 найдены 2 уникальных SNPs, а в популяции Ls7 – 5, в остальных выявлено по 1 уникальному SNP-маркеру. В среднем с наибольшей частотой SNPs встречались в популяции Ls5 (0,450), а с меньшей (0,130) – в популяции Ls4 (табл. 1).

Установленные при молекулярно-генетическом анализе параметры генетического разнообразия L. sibirica разделены на четыре группы (табл. 1). К первой (1) группе относятся «Основные показатели генетического разнообразия», вторую группу (2) параметров генетического разнообразия составляют показатели внутрипопуляционного разнообразия, третья группа (3) характеризует генетическую структуру и дифференциацию популяций (табл. 1). Важной группой параметров генетического разнообразия является четвертая (4), так как характеризует «специфику» генофонда. Высокие значения КГО популяции свидетельствуют о повышенном присутствии редких для региона исследований аллелей и соответственно специфичности ее генофонда, а популяции с минимальным значением КГО имеют минимальные частоты и число редких аллелей. Такие популяции характеризуются наиболее типичным или базовым генофондом [6]. При характеристике специфичности генофондов необходимо учитывать не только значения КГО, но также присутствие и число уникальных аллелей в популяции, так как наличие таких аллелей может указывать на особенности структуры генетического разнообразия популяций. Наибольшие значения КГО имеет популяция Ls5 (КГО=1,171), кроме того в ней обнаружены уникальные аллели, выявленные с помощью как ISSR-, так и SNP-маркеров (табл. 1). Эта популяция является самой западной и располагается на большом расстоянии от других изученных популяций, вероятно в связи с этим в ней сосредоточены нетипичные для региона исследований аллели, что может быть обусловлено историей расселения вида в регионе и формированием его ареала из различных популяционных систем. Вторым по величине КГО и, соответственно, нетипичными аллелями обладает девятая популяция L. sibirica (КГО=0,939). Она расположена в предгорной области восточного макро-склона вблизи границы Среднего и Южного Урала и является самой южной из изученных популяций. В ней также обнаружены уникальные аллели, выявленные с помощью обоих типов ДНК-маркеров.

Таблица 1

Оценка состояния генофондов популяций L. sibirica

Популя-

ция

1. Основные показатели генетического разнообразия

2. Внутрипопуля-

ционное разнообразие

3. Генетическая структура и дифференциация

4. Специфика

генофондов

P95

HE

I

μ

Hd

hISSR

hSNP

UnISSR/SNP

КГО

Ls1

0,772

0,172

0,271

1,639

0,872

0,181

0,154

0/1

0,935

Ls2

0,806

0,182

0,287

1,664

0,871

0,168

0,075

0/1

0,925

Ls3

0,806

0,189

0,298

1,698

0,887

0,151

0,111

1/2

0,760

Ls4

0,821

0,225

0,313

1,703

0,857

0,148

0,117

0/0

0,587

Ls5

0,871

0,223

0,338

1,774

0,836

0,113

0,078

1/1

1,171

Ls6

0,816

0,213

0,328

1,714

0,859

0,143

0,091

2/1

0,776

Ls7

0,741

0,168

0,258

1,626

0,883

0,187

0,160

0/5

0,703

Ls8

0,768

0,200

0,305

1,664

0,636

0,168

0,258

0/1

0,930

Ls9

0,872

0,242

0,369

1,738

0,911

0,131

0,126

1/1

0,939

Примечание: P95 – доля полиморфных локусов; HE – ожидаемая гетерозиготность; I – информационный индекс Шеннона; μ – показатель внутрипопуляционного разнообразия; Hd – общее гаплотипическое разнообразие; hISSR – доля редких морф, рассчитанная на основании ISSR-маркирования; hSNP – доля редких морф, рассчитанная на основании SNP-маркирования; UnISSR/SNP – число уникальных аллелей, выявленных с помощью ISSR- и SNP-маркеров; КГО – коэффициент генетической оригинальности.

Наименьшее значение КГО имеет четвертая популяция (КГО=0,587), располагающаяся на севере Пермского края почти в центре района среднетаежных лесов, занимающих здесь огромные территории с непрерывным ареалом и практически не затронутые человеческой деятельностью (табл. 1). Вероятно, вследствие этого популяция Ls4 характеризуется наиболее типичным генофондом. Уникальные маркеры в данной популяции не обнаружены. Таким образом, для ранжирования генофондов по степени специфичности предлагаются следующие интервалы: с КГО от 0,580 до 0,930 – типичный; с КГО от 0,930 и выше – специфичный, но при этом необходимо также учитывать наличие уникальных аллелей. Так, в популяции Ls7 с КГО=0,703 выявлено наибольшее число (5) уникальных (то есть специфичных) аллелей, выявленных с помощью SNP-маркеров, поэтому генофонд данной популяции может быть отнесен к специфичным (табл. 1).

Для оценки состояния генофондов популяций все избранные показатели генетического разнообразия переведены в разработанную на примере изученных природных популяций L. sibirica шкалу оценки состояния генофондов. На основании данной шкалы установлено, что в высокой степени удовлетворительное состояние (Ia) характерно для генофондов популяций Ls5 и Ls9 (табл. 2); в средней степени удовлетворительном (Iб) состоянии находятся генофонды шести популяций L. sibirica (табл. 2), а в одной популяции наблюдается тенденция к обеднению генофонда (Ls7), его состояние оценено как средняя степень обеднения – IIa (табл. 2, рисунок).

Таблица 2

Шкала оценки состояния генофондов популяций L. sibirica

Состояние генофонда

P95

HE

I

μ

Hd

hISSR/SNP

Un1

КГО

I Удовлетворительное

>0,750

>0,170

>0,300

>1,650

>0,750

<0,200

>3

>0,900

высокая степень

>0,820

>0,220

>0,350

>1,700

>0,870

<0,150

>1,100

средняя степень

0,750-0,820

0,170-0,220

0,300-0,350

1,650-1,700

0,750-0,870

0,200-0,150

0,900-1,100

II Обеднение генофонда

0,550-0,750

0,100-0,170

0,200-0,300

1,500-1,650

0,550-0,750

0,300-0,200

1-2

0,500-0,900

IIа

средняя степень

0,650-0,750

0,130-0,170

0,250-0,300

1,550-1,650

0,650-0,750

0,250-0,200

0,700-0,900

IIб

сильная степень

0,550-0,650

0,100-0,130

0,200-0,250

1,500-1,550

0,550-0,650

0,300-0,250

0,500-0,700

III Деградация генофонда

<0,550

<0,100

<0,250

<1,500

<0,550

>0,300

<1

<0,500

IIIа

средняя степень

0,450-0,550

0,050-0,100

0,200-0,250

1,300-1,500

0,450-0,550

0,350-0,300

 

0,400-0,500

IIIб

сильная степень

<0,450

<0,050

<0,200

<1,500

<0,450

>0,350

<0,400

Примечание: P95 – доля полиморфных локусов; HE – ожидаемая гетерозиготность; I – информационный индекс Шеннона; Hd – общее гаплотипическое разнообразие; μ – показатель внутрипопуляционного разнообразия hISSR/SNP – доля редких морф, рассчитанная на основании ISSR- и SNP-маркирования; Un1 – общее число уникальных аллелей, выявленных с помощью ISSR- и SNP-маркеров; КГО – коэффициент генетической оригинальности.

С целью сохранения генофонда ценного ресурсного вида растений L. sibirica рекомендуется отбирать как популяции с типичными (базовыми) генофондами, так и популяции, обладающие специфическими особенностями генофондов, являющиеся резервом генетической изменчивости.

Оценка состояния генофондов на примере двух популяций L. sibirica; P95, HE, I, Hd, μ, hISSR, hSNP, UnISSR, UnSNP, КГО – показатели генетического разнообразия; справа – шкала оценки состояния генофондов

Для отбора в качестве объектов сохранения могут быть рекомендованы популяции со специфическими генофондами, обладающие высоким уровнем генетического разнообразия. Например, такие как популяции Ls5 и Ls10, характеризующиеся высокими значениями КГО и наибольшими показателями генетического разнообразия. Кроме того, популяция Ls7, для которой характерно в целом обедненное состояние генофонда, имеет наибольшее число уникальных SNPs-маркеров и высокий показатель гаплотипического разнообразия, поэтому может быть рекомендована для отбора в качестве резерва генетической изменчивости на нуклеотидном уровне при сохранении генофонда вида (рисунок). Для сохранения базовых генофондов лиственницы сибирской предлагается популяция Ls4, для которой характерно в целом в средней степени удовлетворительное состояние генофонда, отсутствие уникальных маркеров и сбалансированная генетическая структура. Так же типичным генофондом обладает популяция Ls2. Данная популяция характеризуется высоким уровнем генетической изменчивости и внутрипопуляционного разнообразия, доля редких морф (hISSR=0,168; hSNP=0,075) свидетельствует о практически ненарушенной генетической структуре. Она находится на территории заповедника «Вишерский» на высоте около 800 метров над уровнем моря и поэтому может быть использована для сохранения генофонда L. sibirica в горах.

Заключение

Таким образом, на основании данных о генетическом разнообразии, полученных с помощью двух типов молекулярных маркеров, установлено, что в удовлетворительном состоянии находятся генофонды восьми изученных популяций, а в одной популяции (Ls7) отмечены признаки обеднения генофонда. Наибольшие значения коэффициента генетической оригинальности (КГО) как интегрального показателя популяционного разнообразия установлены в популяциях Ls5 и Ls10. Для отбора в качестве объектов сохранения генофондов рекомендуются популяции с типичными и специфическими генофондами. Изучение генетической изменчивости природных популяций древесных растений и оценка состояния их генофондов могут быть использованы для составления генетически обоснованных программ по сохранению, восстановлению и рациональному использованию лесных генетических ресурсов.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы «УМНИК» Фонда содействия развития малых форм предприятий в научно-технической сфере (2013–2015 гг.).


Библиографическая ссылка

Нечаева Ю.С., Жуланов А.А., Красильников В.П., Боронникова С.В. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ГЕНОФОНДОВ ПОПУЛЯЦИЙ ЗАПАДНОЙ РАСЫ ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ LARIX SIBIRICA LEDEB. (L. SUKACZEWII) НА СРЕДНЕМ И СЕВЕРНОМ УРАЛЕ // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 3.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24520 (дата обращения: 30.07.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074