В медицинской практике широко применяются лекарственные препараты на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС), содержащего флавоноиды, которые обусловливают широкий спектр биологической активности [3]. Особый интерес представляют антиоксидантные свойства флавоноидов, среди которых дигидрокверцетин (таксифолин), являющийся компонентом древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica L.), используется в качестве лекарственной субстанции для производства препарата «Диквертин», а также целого ряда биологически активных добавок [3].

Близкими по строению к дигидрокверцетину (1) является кверцетин (2) и его 3-О-рутинозид (рутин) (3), широко встречающиеся в лекарственных растениях. Кроме того, дигидрокверцетин (1) является фрагментом в молекуле силибина (4) и других флаволигнанов плодов расторопши пятнистой [Silybum marianum (L.) Gaertn.], служащих ценным источником гепатопротекторных лекарственных средств (силибинин, легалон, силимар, карсил и др.) [3]. Данное обстоятельство делает актуальным сравнительное изучение близких по строению флавоноидов, а также лекарственных препаратов на их основе.

Цель настоящих исследований - сравнительное исследование антиоксидантной активности некоторых флавоноидов и лекарственных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой.

Материал и методы исследования

Исследования антиоксидантной активности флавоноидов и лекарственных препаратов на основе плодов расторопши пятнистой (силимар, карсил) проведены на модели токсического гепатита, вызванного интоксикацией четыреххлористым углеродом в ткани печени крыс [5]. При этом было применено многократное введение четыреххлористого углерода крысам в дозе 2,0 г/кг веса животного. 50%-ный масляный раствор четыреххлористого углерода вводился крысам внутримышечно ежедневно в течение шести дней.

Исследование осуществляли на белых половозрелых лабораторных крысах обоего пола массой тела 200-260 граммов. Крысы находились на обычном рационе вивария и были вовлечены в эксперимент одновременно, что исключает влияние внешних температурных, климатических и иных факторов на разницу активности ферментов у опытных и контрольных групп животных. Во время эксперимента доступ крыс к воде и корму был свободным.

Флавоноиды и фитопрепараты вводились опытным крысам внутрижелудочно через зонд ежедневно в течение 6 дней параллельно с введением четыреххлористого углерода: силимар и карсил вводились в дозе 50 мг/кг массы тела, а индивидуальные вещества – дигидрокверцетин (1), кверцетин (2), рутин (3) и силибин (4) (рис. 1) в дозе 25 мг/кг.

Контрольной группе крыс 50%-ный масляный раствор четыреххлористого углерода вводился ежедневно в течение 6 дней. Была задействована интактная группа крыс, а также группа крыс, получавшая наряду с четыреххлористым углеродом 40%-ный спирт в дозе 0,2 мл/кг, в 10 раз разбавленный водой. На седьмой день крыс забивали, у них удаляли печень. Крысы забивались в соответствии с этическими нормами под эфирным наркозом методом декапитации. Печень крыс была значительно увеличена в объеме и макроскопически изменена, ткань печени на разрезе приобретала серый оттенок. После извлечения печень промывалась физиологическим раствором и сразу замораживалась в сосуде с твердой углекислотой («сухим льдом») при температуре -70 … -80 °С. Затем из ткани печени готовился гомогенат для проведения анализа на содержание малонового диальдегида (МДА), а также определения активности супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и каталазы. Гомогенат готовился механическим измельчением ткани печени массой 1 грамм с 5 мл фосфатного буфера (рН 7,4) со скоростью 5000 об/мин в сосуде с двойными стенками, постоянно охлаждаемом проточной водой.

Все данные активности ферментов и уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) рассчитывались на содержание белка. Определение белка в печеночной ткани производилось микробиуретовым методом [7]. Определение конечного продукта перекисного окисления липидов осуществляли на основе принципа [6], в соответствии с которым при высокой температуре в кислой среде МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашен­ный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при длине волны 532 нм. Определение активности каталазы основано на способности перекиси водорода образо­вывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс [2]. В гомогенате печени определяли также активность супероксиддисмутазы (СОД) - фермента, инактивирующего супероксидные радикалы и уменьшающего интенсивность перекисного окисления липидов. Супероксиддисмутаза относится к числу ферментов, входящих в состав антиоксидантной защитной системы организма. Активность СОД определяли по методу, описанному в литературе [1]. Определение активности глутатионпероксидазы осуществляли в соответствии с известной методикой [4].

Дигидрокверцетин (1), рутин (3) и силибин (4) выделены в индивидуальном виде с использованием колоночной хроматографии (силикагель L 40/100) соответственно из древесины лиственницы сибирской, травы гречихи посевной и плодов расторопши пятнистой. Кверцетин (2) получен в ходе кислотного гидролиза рутина (3) с последующей перекристаллизацией из водного спирта. Химическое строение выделенных веществ устанавливали с использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии, а также сравнением физико-химических констант и хроматографической подвижности (ТСХ-анализ) с достоверно известными образцами веществ.

Кроме того, для доказательства химического строения флавоноидов использованы современные методы исследования: УФ-, ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате исследований было установлено, что при интоксикации четыреххлористым углеродом в дозе 2,0 г/кг в печени повышается интенсивность перекисного окисления липидов, что проявляется в увеличении содержания малонового диальдегида в гомогенате (табл. 1). Из таблицы 1 видно, что при интоксикации четыреххлористым углеродом в дозе 2,0 г/кг при параллельном введении спирта в дозе 0,2 мл/кг в печени повышается интенсивность перекисного окисления липидов и снижается противоперекисная защита, понижается активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. Показано, что спирт не влияет в значительной мере на токсическое действие четыреххлористого углерода, так как не нормализует перекисное окисление липидов печени крыс и активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы гепатоцитов (табл. 1-4). Поэтому применение его в качестве растворителя не изменяет картину антиоксидантного, гепатопротекторного действия фитопрепаратов.

Определено, что влияние на уровень МДА, как конечного продукта ПОЛ, среди индивидуальных веществ в наибольшей мере оказывает дигидрокверцетин (снижается на 34,5% по сравнению с контрольной группой). Далее антиоксидантная активность уменьшается в ряду: силибин, рутин, кверцетин. Исследованные фитопрепараты по способности тормозить ПОЛ уступают индивидуальным флавоноидам, причем их активность сопоставима (табл. 1).

Установлено, что активность СОД увеличивается в наибольшей степени под влиянием кверцетина (увеличение на 70,3%). Далее антиоксидантная активность уменьшается в ряду: дигидрокверцетин, силибин, рутин. Интересно отметить, что способность активности СОД, выявленная для карсила и силимара, сопоставима с таковой силибина – индивидуального флаволигнана расторопши пятнистой (табл. 2).

Изучено, что активность каталазы возрастает в наибольшей мере под влиянием кверцетина (увеличивается на 26,3%) (табл. 3). Далее активность уменьшается в ряду: силибин, рутин, дигидрокверцетин (табл. 3). Что касается препаратов (карсил и силимар), то их активность сопоставима с таковой индивидуальных веществ (табл. 3).

Определено, что активность ГП возрастает в наибольшей мере под влиянием кверцетина (возрастает на 35,3%); далее активность уменьшается в ряду: дигидрокверцетин, силибин, рутин (табл. 4). При этом важно подчеркнуть, что активность исследованных фитопрепаратов сопоставима с таковой по способности силибина – индивидуального флаволигнана расторопши пятнистой (табл. 4).

Таблица 1

Влияние фитопрепаратов на уровень малонового диальдегида

Таблица 2

Влияние фитопрепаратов на активность супероксиддисмутазы

Таблица 3

Влияние фитопрепаратов на активность каталазы

Таблица 4

Влияние фитопрепаратов на активность глутатионпероксидазы