Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Златник Е.Ю. 1 Ситковская А.О. 1 Шульгина О.Г. 1 Бондаренко Е.С. 1 Золотарева Е.И. 1 Гречкин Ф.Н. 1 Харагезов Д.А. 1 Каймакчи Д.О. 1

---

1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России

Проведено экспериментальное изучение влияния введения вакцинного штамма вируса болезни Ньюкасла на рост перевивной опухоли карциномы Герена, продолжительность жизни и показатели клеточного иммунитета крыс-опухоленосителей. Работа выполнена на 19 белых беспородных крысах-самцах с перевивной карциномой Герена. Вирус-вакцину вводили в разовой дозе 5000 прививных доз паратуморально 2 раза в неделю, всего 4 раза: 1-й группе крыс введение начинали через 1 день после перевивки опухоли, 2-й группе – за неделю до перевивки. В периферической крови, собранной из бедренной вены животных, определяли субпопуляционный состав лимфоцитов 2 раза в неделю в течение двух недель по окончании введения вируса 2-й группе. Относительное количество T- и В-лимфоцитов исследовали методом проточной цитофлюориметрии. Результаты позволили установить различия характера иммунологических изменений, развивающихся у крыс-опухоленосителей, в зависимости от времени введения вируса по отношению к моменту перевивки опухоли и их возможную значимость для получения профилактического эффекта на развитие перевивной опухоли у некоторых животных. Вирус болезни Ньюкасла в ранние сроки после введения вызывает выраженное повышение уровня Т-клеток с маркером ранней активации при снижении уровня CD3+CD8+ клеток у животных еще до перевивки им опухоли Герена, а после перевивки у них отмечались более высокие уровни CD3+CD4+ лимфоцитов по сравнению с другими группами. У контрольных животных во все сроки исследования наблюдалось наиболее высокое содержание CD3+CD8+ и наиболее низкое CD3+CD25+ клеток.

Статья в формате PDF

243 KB

вирус болезни ньюкасла

онколизис

лимфоциты

1. Ottolino-Perry K., Diallo J.S., Lichty B.D., Bell J.C., McCart J.A. Intelligent design: combination therapy with oncolytic viruses // Mol Ther. – 2010. – V. 18, № 2. – P. 251–263.

2. Yamamoto M., Curiel D.T. Current Issues and Future Directions of Oncolytic Adenoviruses // Molecular Therapy. – 2010. – V. 18, № 2. – P. 243–250.

3. Святченко В.А., Тарасова М.В., Нетесов С.В. и др. Онколитические аденовирусы в терапии злокачественных новообразований: современное состояние и перспективы // Молекулярная биология. – 2012. – Т. 46. – С. 556–569.

4. Goetz C., Gromeier M. Preparing an oncolytic poliovirus recombinant for clinical application against glioblastoma multiforme // Cytokine Growth Factor Rev. – 2010. – V. 21. – P. 197–203.

5. Rudin C.M., Poirier J.T., Senzer N.N., Stephenson J.Jr., Loesch D., Burroughs K.D., Reddy P.S., Hann C.L., Hallenbeck P.L. Phase I clinical study of Seneca Valley Virus (SVV-001), a replicationcompetent picornavirus, in advanced solid tumors with neuroendocrine features // Clin. Cancer. Res. – 2011. – V. 17. – P. 888–895.

6. Israelsson S., Jonsson N., Gullberg M., Lindberg A.M. Cytolytic replication of echoviruses in colon cancer cell lines // Virology Journal. – 2011. – V. 8. – P. 473.

7. Skelding K.A., Barry R.D., Shafren D.R. Enhanced oncolysis mediated by Coxsackievirus A21 in combination with doxorubicin hydrochloride // Invest New Drugs. – 2012. – V. 30, № 2. – P. 568-81.

8. Кешелава В.В., Добровольская Н.Ю., Подольская М.В., Гармарник Т.В. Результаты исследования онколитического вируса болезни Ньюкасла в неоадъювантной терапии рака молочной железы за 3-летний период наблюдения // Вестник РНЦРР. – 2010. – № 10. – С.1-12.

9. Fournier P., Schirrmacher V. Oncolytic Newcastle Disease Virus as Cutting Edge between Tumor and Host // Biology. – 2013. – V. 2, № 3. – P. 936–975.

10. Laurie S.A., Bell J.C., Atkins H.L., Roach J., Bamat M.K., O'Neil J.D., Roberts M.S., Groene W.S., Lorence R.M. A Phase 1 Clinical Study of Intravenous Administration of PV701, an Oncolytic Virus, Using Two-Step Desensitization // Clin. Cancer. Res. – 2006. – V. 12, № 8. – Р. 2555–2562.

11. Liang W., Wang H., Sun T-M., et al. Application of autologous tumor cell vaccine and NDV vaccine in treatment of tumors of digestive traet // World Journal of Gastroenterology. – 2003. – V. 9, № 3. – P. 495–498.

12. Юрченко К.С., Губанова Н.В., Шестопалова Л.В., Щелканов М.Ю., Шестопалов А.М. Онколитические свойства вируса болезни Ньюкасла // Тихоокеанский медицинский журнал. – 2015. – № 3. – С. 14–18.

13. Schirrmacher V. Immunobiology of Newcastle Disease Virus and Its Use for Prophylactic Vaccination in Poultry and as Adjuvant for Therapeutic Vaccination in Cancer Patients // International Journal of Molecular Sciences. – 2017. – V. 18, № 5. – P. 1103.

В настоящее время для биотерапии опухолей считается многообещающим сочетание стратегий, направленных как на разрушение опухолевых клеток, так и на индукцию иммунного ответа против них путем активации врожденного и адаптивного иммунитета. Перспективной в этом плане является онколитическая виротерапия (ОВ) с использованием непатогенных для человека вирусов, избирательно накапливающихся в опухолевых клетках. Стимуляция долгосрочных противоопухолевых иммунных реакций в организме опухоленосителя считается важным компонентом индукции противоопухолевого эффекта при проведении виротерапии, которая может стать основой нового подхода к лечению рака; возможно, в сочетании со стандартной терапией [1].

При выборе ОВ для разработки биотерапевтических продуктов принципиальным моментом является их непатогенность для человека. Первыми официально разрешенными вирусными противоопухолевыми препаратами стали генномодифицированные штаммы аденовируса человека с повышенной избирательностью действия на опухолевые клетки [2, 3]. Помимо них предложены еще некоторые онколитические вирусы, которые проходят клинические испытания, такие как пикорнавирусы родов: polio- [4], сене-SVV [5]; энтеровирусы ECHO [6] и Коксаки А21 [7]. Однако наиболее привлекательными в качестве противоопухолевых препаратов являются онкотропные вирусы животных, к которым у человека нет приобретенного в детстве иммунитета (вирусы болезни Ньюкасла, энтеровирусы, парвовирусы животных, вирус везикулярного стоматита и поксвирусы: осповакцины и оспы птиц) [8]. Одними из перспективных представляются вирусы семейства Paramyxoviridae, в частности вирус болезни Ньюкасла (ВБН), не являющийся патогенным для человека [9] и обладающий онколитическим и иммуностимулирующим действием.

В США была проведена I фаза клинических испытаний штамма PV701 ВБН. В этом исследовании принимали участие 79 пациентов с различными прогрессирующими онкологическими заболеваниями, которым не помогала традиционная терапия. У некоторых пациентов под действием внутривенного введения PV701 наблюдалось развитие частичного ответа на лечение [10]. Liang и соавт. (2003) сообщали об обширном исследовании, в котором терапию опухолей ЖКТ проводили вакциной из аутологичных опухолевых клеток, модифицированных нелитическим штаммом La Sota ВБН. Это была III фаза исследования, в которой сравнивали 310 пациентов с резецированным колоректальным раком I–IV стадий и проведенной иммунотерапией с 257 пациентами, получавшими только хирургическое лечение. Медиана общей выживаемости в группе с вакцинациями составляла более 7 лет по сравнению с 4,46 годами в группе только с резекцией. Данные были статистически значимыми [11].

В последние годы предложен ряд препаратов на основе вирусов (Ригвир, Канцеролизин, Онкорин); исследования по отбору и генетической модификации ОВ с целью усиления их противоопухолевых свойств продолжаются.

Цель исследования. Экспериментальное изучение влияния введения вакцинного штамма ВБН на рост перевивной опухоли карциномы Герена, продолжительность жизни и показатели клеточного иммунитета крыс-опухоленосителей.

Материал и методы исследования. В работе использован препарат «Вакцина против Ньюкаслской болезни (НБ) живая сухая (штамм Ла-Сота)».

Работа выполнена на 19 белых беспородных крысах-самцах. Для индукции опухолевого процесса животным подкожно перевивалась карцинома Герена. Вирус-вакцину ВБН вводили в разовой дозе 5000 прививных доз (1 флакон) паратуморально, 2 раза в неделю, всего 4 раза: 1-й группе крыс введение начинали через 1 день после перевивки опухоли, 2-й группе – за неделю до перевивки. Животным контрольной группы подкожно вводили физиологический раствор. В 1-й и 2-й группах было по 7 животных, в 3-й (контрольной) – 5 крыс. Все процедуры введения препарата фиксировались в листе введения.

Наблюдение за животными и замеры опухоли с вычислением ее объема проводили ежедневно, фиксируя результат в протоколе эксперимента. Сведения о погибших животных отмечали в протоколе.

Правовые и этические нормы содержания и использования животных соблюдались в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

В периферической крови, собранной из бедренной вены животных, определяли субпопуляционный состав лимфоцитов 2 раза в неделю в течение двух недель по окончании введения вируса второй группе. Относительное (процентное) количество Т- и В-лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD25+, CD45RA+ клеток) исследовали методом проточной цитофлюориметрии с помощью моноклональных антител (МАТ) фирмы BD Pharmingen Rat T/B/NK Cell Cocktail, BD Pharmingen Rat Activated T Lymphocyte, BD Pharmingen Rat T Lymphocyte Cocktail по методике, рекомендованной производителем.

Интерпретация результатов производилась согласно стандартам иммунофенотипирования и специально разработанным алгоритмам.

Результаты исследования и их обсуждение. Как видно из рисунка 1, у крыс 2-й группы с введением ВБН до перевивки отмечен меньший объем опухоли по сравнению с теми, кому ВБН вводили после перевивки карциномы Герена; различия регистрировались на протяжении 6 недель наблюдения, однако не достигали статистической достоверности вследствие широкой индивидуальной вариабельности внутри каждой из сравниваемых групп.

Рис. 1. Средние объемы опухоли у крыс 2-й и 1-й опытных групп, получавших ВБН.

Ось Х – недели после перевивки; Ось Y – объем опухоли (см3)

Крысы 2-й группы, которым введение ВБН начинали до перевивки, погибли на 21-й, 28-й, 37-й, 57-й дни после нее; средняя продолжительность жизни составляла 35,8±10,1 дней. Крысы 1-й группы, которым ВБН вводили после перевивки опухоли, погибли на 29–45-й дни после перевивки, средняя продолжительность жизни составляет 34,0±2,1 дня.

Рис. 2. Общая выживаемость крыс 1-й и 2-й групп, получавших ВБН

Как видно из рисунка 2, различия общей выживаемости крыс в зависимости от времени введения ВБН были статистически недостоверны; их продолжительность жизни после перевивки не отличалась и от контроля (таблица). Однако в отличие от крыс, которым ВБН вводили после перевивки опухоли Герена, среди животных, получавших ВБН до перевивки, были такие, у которых опухоль не перевилась или регрессировала на ранних сроках (2–3 недели после перевивки). Таких крыс было 3 из 7, их не учитывали при расчете продолжительности жизни, поскольку они живы более 6 месяцев. В 1-й группе таких крыс не было, опухоль развилась у всех 7 животных и не регрессировала ни у одного (таблица).

Динамика роста перевиваемой карциномы Герена и продолжительность жизни крыс опытных и контрольной групп

Результаты иммунологических исследований, проведенных у животных, получавших ВБН, и контрольных в динамике наблюдения, представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Уровни CD3+CD4+ (А), CD3+CD8+ (Б), CD3+CD25+ (В), CD45RA+ (Г) в динамике наблюдения у крыс после перевивки карциномы Герена. Ось Y – %

Как видно из рисунка 3А, уровень CD3+CD4+ лимфоцитов в динамике проведения эксперимента в контрольной и в 1-й опытной группах снижался, а во 2-й опытной (с предварительным введением ВБН) не имел статистически значимых отличий от исходных и возрастал по сравнению с контрольной (3-й) и 1-й группой. Так, через 3 недели уровень CD3+CD4+ у крыс 2-й группы составлял 42,0±5,7%, а в контроле – 27,3±2,3% (р<0,05); через 4 недели различия сохранялись (38,7±11 против 18,5±1,6%; р<0,05). У животных 1-й группы происходило статистически достоверное снижение этих лимфоцитов через 4 недели (с 35,9±4,5 до 20,6±3,7%, р<0,05). Интересно, что введение ВБН животным, которым опухоль еще не перевивали, не вызвало изменения уровня CD3+CD4+, в отличие от уровня CD3+CD8+ клеток, количество которых снижалось под воздействием введения ВБН еще до перевивки опухоли (рис. 3Б).

Как видно из рисунка 3Б, после перевивки опухоли количество CD3+CD8+ оказалось максимальным в контрольной группе, особенно на 2-й неделе после перевивки. В этот срок, а также через 4 недели оно статистически достоверно превышало уровни этих клеток у крыс обеих опытных групп (через 2 недели 41,1±7,0% против 11,0±2,4% в 1-й и 13,5±2,5% во 2-й группе; через 4 недели 22,1±4,9% против 11,6±2,0% в 1-й и 11,3±1,3% во 2-й группе; во всех случаях р<0,05).

Как видно из рисунка 3В, введение ВБН вызывает повышение уровня активированных Т-клеток с маркером ранней активации (CD25+), который в дальнейшем после перевивки в обеих опытных группах менялся волнообразно. Количество этих клеток у контрольных животных постепенно возрастало, хотя ко 2-й неделе было статистически достоверно ниже, чем в обеих опытных группах (0,78±0,28% против 2,91±0,33% и 2,99±0,34% соответственно, р<0,05), а к 4-й неделе и не достигало значений, наблюдаемых у опытных крыс 1-й группы (1,47±0,3% и 2,79±0,16% соответственно, р<0,05).

Как видно из рисунка 3Г, уровни В-лимфоцитов не меняются после введения ВБН, однако через 2 недели после перевивки опухоли у крыс 1-й и 2-й групп они превышают контрольные показатели в 2 раза, а затем снижаются до уровня контрольных животных.

Комбинация иммунотерапии и виротерапии опухолей предполагает их синергизм, включающий инициацию иммунного ответа на антигены вирусов, а также частично разрушенных под действием онколитических вирусов опухолевых клеток. Механизмы цитопатического действия ВБН связаны с индукцией апоптоза, апоптоз-опосредованного некроза, аутофагии и синцитиеобразованием. Хотя штамм ВБН Ла-Сота и считается нелитическим, т.е. не приводящим к образованию синцития, у него описан такой механизм повреждения опухолевых клеток, как индукция апоптоза [12], показанный in vitro, а его иммуногенные свойства могут быть использованы для стимуляции противоопухолевого ответа [13].

В нашей работе оценка показателей Т- и В-клеточного звена у крыс продемонстрировала, что введение ВБН до перевивки опухоли Герена вызывает выраженное повышение уровня Т-лимфоцитов с маркером ранней активации (CD3+CD25+) при снижении уровня CD3+CD8+ клеток. Мы предполагаем, что такая подготовка дает возможность сохранять более высокие уровни CD3+CD25+ и CD3+CD4+ лимфоцитов при последующей перевивке опухоли Герена по сравнению не только с контрольными животными, но и с теми, кому опухоль перевивали раньше, чем начинали вводить ВБН. Отсутствие роста опухоли у части животных, предварительно получавших ВБН, на наш взгляд, связано с полученной стимуляцией Т-клеток, сохраняющейся и в динамике наблюдения. Введение вакцины против ВБН способно не только оказывать профилактическое действие при применении для иммунизации против бронхита птиц, но и предупреждать развитие перевиваемой опухоли, хотя последнее получено и не у всех животных. Возможно, для достижения более полного эффекта следует комбинировать применение ВБН с другими методами противоопухолевых воздействий.

Заключение. Итак, показатели Т- и В-клеточного звена в исследуемых группах крыс демонстрируют, что ВБН в ранние сроки после введения вызывает выраженное повышение уровня Т-лимфоцитов с маркером ранней активации при снижении уровня CD3+CD8+ клеток. При последующей перевивке опухоли Герена таким животным отмечена стимуляция у них CD3+CD4+ и CD3+CD25+ лимфоцитов, в отличие от контрольных крыс. Судя по полученным результатам, стимуляция Т-клеточного звена иммунной системы крыс с помощью предварительного введения ВБН способствует индукции у части животных противоопухолевого эффекта в виде отсутствия роста опухоли или ее регрессии в ранние сроки.

Библиографическая ссылка