Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

МОРФОЛОГИЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ТИМУСА ПРИ ВТОРИЧНОЙ ИММУННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ

Москвичев Е.В. 1 Меркулова Л.М. 1 Стручко Г.Ю. 1
1 ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова», Чебоксары
С применением иммуногистохимического метода и компьютерной морфометрии исследованы особенности морфологии и молекулярного фенотипа вилочковой железы у крыс через 1 и 4 месяца после удаления селезенки. В работе использованы моно- и поликлональные антитела к мульти-цитокератинам, CD3, синаптофизину, белку S100 и p53. Установлено, что спленэктомия сопровождается атрофией тимуса, схожей по морфологии с возрастной инволюцией, но протекающей значительно быстрее. Кроме того, инволюция тимуса сопровождается существенным изменением молекулярного фенотипа тимической дольки с перестройкой компонентов тимопоэтического микроокружения и изменением соотношения тимоцитов коркового и мозгового вещества. Тем не менее, изменения в структурах железы через четыре месяца после спленэктомии не сопровождаются достоверным повышением экспрессии белка-регулятора апоптоза p-53, что указывает на более сложный механизм инволюции по сравнению со стресс-индуцированной острой атрофией.
спленэктомия
дендритные клетки
тимопоэз
инволюция тимуса
1. Бабаева А. Г. Реактивные изменения в тимусе и селезенке как ответ на хирургическое вмешательство / А. Г. Бабаева, Е. И. Гиммельфарб, И. И. Калинина // Архив патологии. - 1995. - Т. 2. - № 57. - С. 58-61.
2. Стручко Г. Ю. Морфофункциональное исследование тимуса и иммунобиохимических показателей крови после спленэктомии и иммунокоррекции: автореф. дис... докт. мед. наук. - Саранск, 2003. - 23 с.
3. Bai M. Immunohistochemical expression patterns of neural and neuroendocrine markers, the neural growth factor receptors and the beta-tubulin II and IV isotypes in human thymus // Anticancer Research. - 2008. - Vol. 28, № 1(A). - Р. 295-303.
4. Gruver A. L. Cytokines, leptin, and stress-induced thymic atrophy / A.L. Gruver, G. D. Sempowski // Journal of Leukocyte Biology. - 2008. - Vol. 84, № 4. - Р. 915-923.
5. Hale L. P. Histologic and molecular assessment of human thymus // Ann Diagn Pathol. - 2004. - Vol. , № 2. 1. - Р. 50-60.
6. Herold M. Glucocorticoids in T cell apoptosis and function / M. J. Herold, M. J. McPherson, H. M. Reichardt // Cell Mol Life Science. - 2006. - Vol. 63, № 1. - Р. 60-72.
7. Raica M. Structural heterogeneity and immunohistochemical profile of Hassall corpuscles in normal human thymus // Annals of Anatomy. - 2006. - Vol. 188, № 4. - Р. 345-352.
8. Savino W. Hematopoiesis / W. Savino, S. Smaniotto, M. Dardenne // Advances in Experimental Medicine and Biology. - 2005. - № 567. - Р. 167-185.
9. Smith L. K. Glucocorticoid-induced apoptosis of healthy and malignant lymphocytes / L. K. Smith, J. A. Cidlowski // Prog Brain Research. - 2010. - № 182. - Р. 1-30.
10. Takehiro O. Overwhelming postsplenectomy infection syndrome in adults - A clinically preventable disease / O. Takehiro, H. Kazuhiro // World Journal of Gastroenterolgy. - 2008. - Vol. 14, №2. - Р. 176-179.
Введение. Тимус - центральный орган иммуногенеза, который является исключительно чувствительным к стрессорному воздействию, а также подвержен значительным возрастным изменениям. Естественная возрастная инволюция сопровождается атрофией лимфоидной ткани и замещением ее жировой клетчаткой с постепенным снижением тимопоэза. До недавнего времени считалось, что тимус является «одноразовым» органом и необходим лишь растущему организму до полового созревания, а в последующем атрофируется. Однако в дальнейшем было показано, что тимопоэз сохраняется в железе, по крайней мере, до восьмого десятилетия жизни [5].

Одной из наиболее изученных моделей является острая стресс-индуцированная атрофия тимуса, при которой ключевое значение принадлежит глюкокортикоидным гормонам. Известно, что глюкокортикоиды  реагируют с рецепторами тимоцитов и запускают их апоптоз [9]. Хронический стресс также вызывает инволюцию тимопоэтического компонента железы с последующей структурной перестройкой органа и его атрофией, при этом изменения в железе схожи с возрастной инволюцией, но протекают значительно быстрее [4]. Ряд авторов указывают на возможность кратковременного, но обратимого негативного влияния хирургического стресса на тимус [1].

Спленэктомия - широко распространенная хирургическая операция, выполняемая при травматических разрывах органа и операциях  на органах верхнего этажа брюшной полости. Однако удаление это крупнейшего периферического органа иммуногенеза приводит к перестройке цепи взаимодействия иммунокомпетентных органов и снижению защитных сил, а в ряде случаев - развитием синдрома  OPSI (overwhelming post-splenectomy infection) [10].

В предыдущих работах мы установили, что спленэктомия вызывает акцидентальную инволюцию тимуса, признаки которой сохраняются даже через 120 суток после операции. Нами показано, что спленэктомия сопровождается стойким увеличением уровня кортизола в крови, анемией, а также увеличением уровня биогенных аминов в структурах тимуса на фоне инволютивных изменений [2]. Таким образом, было установлено, что влияние спленэктомии на тимус не ограничивается лишь хирургическим стрессом и имеет более сложные механизмы, основанные на нарушениях нейроэндокринных и гуморальных взаимодействий. Тогда же было высказано предположение, что механизм акцидентальной инволюции может быть опосредован через клетки APUD серии и дендритные клетки (ДК) тимопоэтического микроокружения.

Цель исследования - установление морфологических характеристик, иммуногистохимического фенотипа и особенностей цитоархитектоники клеток тимопоэтического компонента вилочковой железы при вторичной иммунной недостаточности после спленэктомии.

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 42 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 грамм в возрасте 5 месяцев. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы были разделены на три группы. Животным первой группы (22 крысы) под общей анестезией выполняли спленэктомию с соблюдением правил асептики и антисептики. Животным второй группы - ложнооперированные  (10) - выполняли лапаротомию без удаления селезенки. Третью группу составили интактные животные (10) соответствующего возраста. Контролем служили интактные и ложнооперированные крысы. Выведение всех групп животных из эксперимента проводилось через 30 и 120 суток после операции путем декапитации. Объектом исследования служил тимус. В работе использованы следующие методы:

1. Иммуногистохимический метод с использованием пяти коммерческих моноклональных (МКАТ) и поликлональных (ПКАТ) антител фирм Santa Cruze (США) и NovoСastra (Великобритания):

а) МКАТ к кластеру дифференцировки лимфоцитов 3 типа;

б) ПКАТ к белку S-100 (маркер нейроэктодермы);

в) МКАТ к синаптофизину (маркер нейроэндокринных клеток);

г) МКАТ к мульти цитокератинам (маркер эпителиальных клеток);

д) МКАТ к белку-регулятору апоптоза  р53.

Материал для исследования иммуногистохимическими методами фиксировали 10 % нейтральным забуференным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм. Срезы наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37 0С в течение 18 часов. Демаскировка и иммуногистохимическая окраска проводилась на автостейнере Leica Bond Max (Германия). Контролем иммуногистохимической реакции служила неиммунизированная кроличья и мышиная сыворотка. Результат реакции оценивали с применением микроскопа Leica DM4000B (Германия) путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в десяти полях зрения при увеличении x400, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения.

2. Окраска срезов тимуса гематоксилином и эозином для проведения морфометрических измерений.

3. Компьютерная морфометрия с использованием лицензионных программ Leica application suite 3.6.0 (Германия) и Микроанализ (Россия).

4. Статистическая обработка с использованием лицензионного пакета программ MS Office 2003, достоверность определялась t-критерием Стьюдента.

Результаты собственных исследований и обсуждение. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов тимуса интактных крыс 6 месяцев антителами к цитокератинам выявляет развитую сеть эпителиальных клеток коркового и мозгового вещества. Эпителиальные клетки занимают 8,3 % площади среза коркового и 21,9 % мозгового вещества дольки (рисунки 1, 2). Окраска антителами к белкам S-100 и синаптофизину выявляет многочисленные клетки нейроэктодермального и нейроэндокринного происхождения, которые локализуются в мозговом веществе и на границе коркового и мозгового вещества. Количество клеток, дающих положительную реакцию с белком S-100, достигает 18,4±2,98 в поле зрения, с синаптофизином - 12,8±3,05. Обработка срезов тимуса антителами к антиапоптотическому белку p-53 выявляет немногочисленные клетки, локализованные в корковом и мозговом веществе, число которых не превышает  6,04 ±1,7 клетки в поле зрения. Окраска тимуса антителами к CD 3 выявляет многочисленные зрелые тимоциты коркового и мозгового вещества, которые занимают 12,3 % площади коркового и 53,1 % площади мозгового вещества.

В тимусе интактных крыс 9 месяцев выявляются признаки возрастной инволюции, которые выражены в снижении массы железы, уменьшении площади дольки и мозгового вещества, а также толщины коркового слоя, но эти морфологические характеристики меняются недостоверно, тогда как количественные показатели иммуногистохимических реакций подвержены существенным изменениям. Установлено, что в тимусе интактных крыс 9 месяцев достоверно возрастает число кортикальных эпителиоцитов, которые занимают 15,7 % (P˂0,01)  площади дольки. В мозговом же веществе отмечено достоверное уменьшение числа этих клеток до 16,9 % (P˂0,01). Окраска препаратов тимуса интактных крыс 10 месяцев антителами к белкам S-100 и синаптофизину выявляет существенное увеличение числа клеток, дающих положительную реакцию, до 34,3±5,3 (P˂0,01) и  22,5±3,45(P˂0,01) соответственно. Обработка тимуса антителами к антиапоптотическому белку p-53 выявляет достоверное увеличение числа клеток, экспрессирующих этот антиген, до 26,8±5,78 (P˂0,001) в поле зрения, при этом клетки располагаются преимущественно периваскулярно. Количество зрелых кортикальных тимоцитов, дающих реакцию с CD 3, возрастает до 28,76 % (P˂0,01), тогда как в мозговом веществе снижается до 35,67 % (P˂0,01). Следует отметить, что изменения в тимусе ложнооперированных крыс на всех сроках достоверно не отличались от значений у интактных животных.

Таким образом, возрастная инволюция сопровождается изменением соотношения эпителиальных клеток в тимической паренхиме с уменьшением их количества  в мозговом веществе, повышением экспрессии антиапоптотического белка p-53 в структурах дольки, увеличением количества клеток нейроэктодермального и нейроэндокринного происхождения, а также разнонаправленным изменением количества зрелых тимоцитов в корковом и мозговом веществе.

Через месяц после удаления селезенки отмечается уменьшение средней массы тимуса, а также площади мозгового и толщины коркового вещества по сравнению с интактными крысами. Окраска препаратов тимуса крыс через месяц после спленэктомии антителами к цитокератинам выявляет достоверное уменьшение количества эпителиальных клеток в мозговом веществе до 13,9 (P˂0,01), тогда как их количество в корковом веществе меняется не достоверно. Обработка срезов антителами к синаптофизину выявляет достоверное увеличение клеток, экспрессирующих этот антиген, до 19,6±0,7 (P˂0,01)  клеток в поле зрения, тогда как число клеток, экспрессирующих S-100, меняется не достоверно. При исследовании антиапоптотического белка p-53 выявлено его достоверное повышение до 8,62 ±0,24 (P˂0,01) клеток в поле зрения. Значимых изменений в количестве зрелых тимоцитов в дольке по сравнению с животными из групп контроля не выявлено.

Через 120 суток после спленэктомии дольки тимуса уменьшены в размерах, в них с трудом прослеживается граница между корковым и мозговым веществом. Междольковые септы расширены и заполнены жировой тканью, на периферии железы определяются скопления крупных клеток с оксифильной цитоплазмой без лимфоцитов. Окраска препаратов тимуса антителами к цитокератинам выявляет густую сеть эпителиальных клеток в сохраненных дольках, а в периферических отделах тимуса - поля эпителиальных клеток без лимфоцитов (рисунки 3,4). При помощи компьютерной морфометрии установлено, что эпителиоциты занимают 20,3 % площади коркового и 22,09 % площади мозгового вещества, однако их количество превышает значения у интактных крыс недостоверно. При обработке препаратов антителами к белкам S-100 и синаптофизину выявляются многочисленные клетки нейроэктодермального и нейроэндокринного происхождения, количество которых достоверно выше (P˂0,01), чем у интактных и ложнооперированных животных (рисунок 4). Окраска антителами к белку-регулятору апоптоза p-53 демонстрирует недостоверное увеличение количества клеток, экспрессирующих этот антиген по сравнению с интактными и ложнооперированными крысами. Исследование экспрессии CD 3 выявило достоверное снижение количества зрелых тимоцитов в мозговом веществе тимуса (P˂0,01), тогда как количество этих клеток в корковом веществе изменяется не достоверно.

Таким образом, инволюция тимуса после спленэктомии сопровождается увеличением числа эпителиальных клеток, достоверным уменьшением количества зрелых тимоцитов в мозговом веществе, а также достоверным повышением количества клеток нейроэндокринного и нейроэктодермального происхождения. Мы считаем, что увеличение количества эпителиальных клеток и в корковом, и в мозговом веществе дольки, вероятно, является относительным и обусловлено уменьшением числа тимоцитов. Известно, что спленэктомия сопровождается длительным повышением уровня кортизола [2], который нарушает поступление в железу костномозговых предшественников и может усиливать апоптоз [6]. В наших экспериментах показано, что спленэктомия сопровождается  достоверным уменьшением количества зрелых тимоцитов в мозговом веществе тимуса, при этом увеличения экспрессии белка-регулятора апоптоза p-53 в его структурах не наблюдается.

Мы также установили, что спленэктомия приводит к увеличению числа клеток тимопоэтического окружения, экспрессирующих белки S-100 и синаптофизин. Известно, что в тимусе позитивную реакцию с маркером нейроэктодермальной дифференцировки S-100 дают медуллярные ДК и некоторые популяции эпителиальных клеток, входящие в состав периваскулярных пространств медуллярной зоны (PVS), а с  синаптофизином -  нейроэндокринные клетки медуллярной зоны, которые причисляют к клеткам АПУД-серии [3, 7]. Нейромедиаторы, выделяемые нейроэндокринными клетками, регулируют деятельность клеток микроокружения тимоцитов и секрецию ими гормонов и интерлейкинов, которые, в свою очередь, необходимы для созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов. Кроме того, нейромедиаторы и белки, выделяемые ДК и клетками APUD-серии, регулируют пролиферацию и апоптоз тимоцитов [8]. Мы считаем, что увеличение числа этих клеток может быть обусловлено как изменением соотношения тимоцитов к компонентам микроокружения вследствие инволюции, так и реакцией этих структур на повышенный уровень кортизола.

Заключение. Таким образом, изменения тимуса в первые четыре месяца после спленэктомии имеют иммунофенотипические и морфологические отличия от возрастной инволюции у крыс соответствующего возраста, при этом они протекают иначе, чем стресс-индуцированная острая атрофия. Вероятно, инволюция тимуса после спленэктомии имеет более сложные патогенетические механизмы, чем стресс-индуцированная атрофия, и реализована через структуры тимопоэтического микроокружения с изменением гормонального и  цитокинового профиля и последующим снижением тимопоэза, без прямой стимуляции апоптоза тимоцитов.

Работа выполнена в рамках гос. контракта № 02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

Рисунки

Рисунок 1. Тимус интактной крысы 6 месяцев. Скопления эпителиальных клеток в корковом веществе. Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400

Рисунок 2. Тимус интактной крысы 6 месяцев. Эпителиальные клетки мозгового вещества, формирующие подобие «сети». Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400

Рисунок 3. Тимус спленэктомированной крысы 9 месяцев. Увеличение числа эпителиальных клеток коркового вещества в сохраненной дольке. Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400

Рисунок 4. Тимус спленэктомированной крысы 9 месяцев. Атрофированная периферическая долька, состоящая из скоплений эпителиальных клеток без лимфоцитов. Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400

Рецензенты:

  • Ямщиков Николай Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой гистологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Самара.
  • Челышев Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань.

Библиографическая ссылка

Москвичев Е.В., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю. МОРФОЛОГИЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ТИМУСА ПРИ ВТОРИЧНОЙ ИММУННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 3.;
URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=6313 (дата обращения: 24.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074