Важной проблемой общей и экспериментальной экологии является изучение действия веществ антропогенного происхождения. Особый интерес представляют фосфорорганические инсектициды (ФОИ), которые согласно заключению ВОЗ относятся к опасным ксенобиотикам окружающей среды. ФОИ, в том числе карбофос, обладают способностью накапливаться в окружающей среде и организме человека, что представляет опасность для здоровья [1; 2]. Механизм токсического действия ФОИ при острых отравлениях хорошо изучен и заключается в последовательном развитии патологических процессов: торможении активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), гиперхолинэргическом сдвиге, токсическом стрессе, гипоксии и нарушении клеточного метаболизма. Карбофос является эффективным нейротоксином, увеличивает выработку активных форм кислорода и перекисное окисление липидов, изменяет эндогенную ферментативную и неферментативную антиоксидантную активность в тканях головного мозга [3; 4]. Несмотря на большое количество исследований, посвященных токсичности фосфорорганических соединений (ФОС) при острых отравлениях, работ, изучающих патофизиологические механизмы повреждений, развивающихся при постоянном, длительном поступлении небольших доз ФОИ, в литературе освещено недостаточно [5]. Поскольку карбофос липофилен, то он быстро всасывается и распределяется по различным органам, вызывая множественные патологии [6; 7]. Известно, что карбофос вызывал хроническое окислительное повреждение головного мозга и поведенческие нарушения, связанные с гибелью нейронов при подостром воздействии на кожу [8]. Исходя из анализа современной литературы, можно заключить значительную потребность в углубленном изучении нейротоксичности ФОС при хронических интоксикациях.
По данным литературы известна роль конституционно-личностных особенностей в развитии многих заболеваний [9]. Индивидуально-типологические особенности поведения животных тесно связаны с индивидуальными характеристиками нервной системы. Так, известна различная индивидуальная чувствительность человека и животных к развитию отрицательных последствий стрессовых воздействий [10]. Генетическая предрасположенность, с одной стороны, и провоцирующие условия факторов внешней среды, действующей на нервную систему, - с другой, во многом определяют развитие патологии в нервно-психической сфере. В доступной литературе работ, выполненных на животных по исследованию индивидуально-типологических особенностей поведения при хронической интоксикации ФОС, не обнаружено. В то же время данные исследования представляют интерес, так как позволяют проследить особенности нарушений нервных механизмов, формирующих индивидуально-специфическое поведение у животных конкретного генотипа, различающихся по поведенческим характеристикам.
Цель исследования: определить особенности изменений в поведенческих реакциях крыс с различным поведенческим статусом при хронической интоксикации карбофосом.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на нелинейных белых крысах-самцах массой 220-250 граммов, которые содержались в стандартных клетках при естественном освещении и свободном доступе к питью и корму, и выполнялось в осенне-зимний период в первой половине дня. Эксперименты проводились в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986), Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Хроническая интоксикация карбофосом достигалась ежедневным внутрижелудочным введением токсиканта в дозе 25 мг/кг (0,05 LD50) в течение 90 суток. Разделение животных на группы с различным поведенческим статусом проводили, определяя у крыс двигательную, исследовательскую и эмоциональную активность в тесте «Открытое поле». Вычисляли индекс активности крыс по формуле: отношение суммы пересеченных квадратов, подъемов на задние лапы и исследований отверстий в открытом поле к сумме длительности латентного периода первого движения и выхода в центр открытого поля [11]. В данном тесте крысы были разделены на поведенчески активные (n=9, индекс активности 3,91±0,58) и пассивные (n=12, индекс активности 0,93±0,14) особи.
Для оценки поведенческого статуса крыс использовали методы «Открытое поле» (ОП), «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и тест Порсолта (ТП). Для проведения данных тестов использовали стандартные, сертифицированные установки, применяя традиционные методические подходы. В условиях теста ОП в течение 5 минут измеряли следующие показатели: двигательную активность по количеству пересеченных квадратов, латентного периода первого движения и выхода в центр ОП; исследовательскую активность, учитывая количество подъемов на задние лапы и заглядываний в отверстия-норки; эмоциональное состояние животных по количеству актов дефекации, уринации и груминга. Уровень тревожности крыс определяли в приподнятом крестообразном лабиринте, оценивая время пребывания в открытых рукавах, а также число выходов на открытое пространство и свешиваний с открытых рукавов за 5 минут тестирования [12]. Оценку уровня депрессивности животных фиксировали в тесте Порсолта. Для этого регистрировали продолжительность первого эпизода активного и суммарную продолжительность эпизодов пассивного (зависания) плавания в пределах 5-минутного интервала наблюдения [13]. Тестирование осуществляли с 10.00 до 14.00, так как в это время крысы проявляют минимальную поведенческую активность. Контролем служили показатели крыс, которые были измерены в исходном состоянии до хронической интоксикации карбофосом.
Обработку полученных результатов проводили, применяя методы вариационной статистики. Описательная статистика данных проводилась в виде средней и среднего квадратичного отклонения М ± σ. Нормальность распределения изучаемых параметров в сравниваемых группах оценивалась тестом Shapiro - Wilk. Достоверность различия между группами крыс определяли с помощью непараметрического критерия Mann - Whitney. Минимальный уровень статистической значимости различий верифицировали при р<0,05. Математическую обработку выполняли на компьютере с применением стандартных пакетов программы Statistica 10.0 (Stat Soft).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты проведенных экспериментов, представленные в таблицах, демонстрируют различия в поведении активных и пассивных крыс при хронической интоксикации карбофосом в тестах «Открытое поле» (ОП), «Приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ) и тесте Порсолта. Анализ поведения крыс в тесте ОП выявил следующие закономерности. Латентный период (ЛП) движения у активных крыс после помещения их в зону открытого поля составил 6,7±1,16 секунды и затем возрастал в ходе хронической интоксикации карбофосом. Увеличение данного показателя на 30-е сутки было умеренным, а на 90-е сутки ЛП увеличился по сравнению с исходным в 1,76 раза (РА=0,005). Следует отметить, что у пассивных крыс исходная величина ЛП в контроле была в 2,1 раза (Р<0,001) выше, чем у активных крыс. В дальнейшем по мере интоксикации карбофосом ЛП двигательной активности пассивных крыс прогрессивно увеличивался в 2,49 раза (Рп=0,005) от исходной величины к 90-м суткам эксперимента. Если посмотреть на динамику прироста, то интенсивность его была выше, чем у активных крыс. Увеличение ЛП свидетельствует о росте тревоги и эмоциональной напряженности крыс при хронической интоксикации карбофосом, что было подтверждено в тестах Порсолта и ПКЛ.
Таблица 1
Показатели поведения активных и пассивных крыс в тесте «Открытое поле» в динамике хронической интоксикации карбофосом (М± σ)
|
Показатели поведения |
Уровень активности крыс |
|||||||
|
Активные (n = 9) |
Пассивные (n = 12) |
|||||||
|
Значение показателей на этапах исследования |
Значение показателей на этапах исследования |
|||||||
|
Контроль |
30-е сутки |
60-е сутки |
90-е сутки |
Контроль |
30-е сутки |
60-е сутки |
90-е сутки |
|
|
Латентный период первого движения (сек.) |
6,7± 1,16
|
7,5± 1,08 РА= 0,15
|
8,8± 1,32 РА= 0,013 |
11,8± 1,32 РА= 0,005
|
13,5± 1,08 Р< 0,001 |
20,0± 1,83 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
27,5±1,9 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
33,6± 1,43 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
|
Латентный период выхода в центр открытого поля (сек.) |
8,7± 1,42
|
10,0± 1,33 РА= 0,025 |
10,8± 1,93 РА= 0,013 |
10,6± 1,9 РА= 0,028 |
20,2± 2,49 Р< 0,001 |
30,8± 2,1 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
37,3±2,16 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
57,4± 4,4 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
|
Двигательная (горизонтальная) активность (n) |
44,9± 4,01
|
43,2± 3,79 РА= 0,38 |
37,1± 4,3 РА= 0,009 |
34,1± 3,54 РА= 0,005 |
25,0± 3,89 Р< 0,001 |
23,5± 3,75 Рп= 0,44 Р< 0,001 |
19,6±3,57 Рп= 0,022 Р< 0,001 |
13,2± 3,65 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
|
Исследовательская (вертикальная) активность (n) |
14,8± 3,05
|
13,4± 2,95 РА= 0,09 |
13,2± 2,66 РА= 0,107 |
9,9± 2,96 РА= 0,007 |
5,3± 1,77 Р< 0,001 |
5,1± 1,97 Рп= 0,77 Р< 0,001 |
4,5± 2,37 Рп= 0,39 Р< 0,001 |
3,5± 1,65 Рп= 0,04 Р< 0,001 |
|
Груминг (сек.) |
2,6± 1,26
|
4,0± 1,76 РА= 0,044 |
4,0± 1,83 РА= 0,09 |
5,4± 2,37 РА= 0,018 |
2,0± 0,82 Р= 0,256 |
1,9± 0,83 Рп= 0,92 Р= 0,013 |
2,0± 1,05 Рп= 1,0 Р= 0,01 |
0,9± 0,74 Рп= 0,011 Р< 0,001 |
|
Количество фекальных болюсов (n) |
1,9± 1,29
|
1,7± 0,82 РА= 0,6 |
3,0± 0,81 РА= 0,076 |
2,9± 0,74 РА= 0,12 |
1,5± 1,35 Р= 0,51 |
3,5± 1,35 Рп= 0,018 Р= 0,004 |
3,6± 1,71 Рп= 0,009 Р= 0,39 |
3,9± 1,6 Рп= 0,005 Р= 0,18 |
|
Индекс активности (усл. ед.) |
3,91± 0,58
|
3,28± 0,57 РА= 0,037 |
2,61± 0,28 РА= 0,005 |
1,98± 0,22 РА= 0,005 |
0,93± 0,14 Р< 0,001 |
0,56± 0,1 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
0,37± 0,06 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
0,18± 0,05 Рп= 0,005 Р< 0,001 |
Примечание. РА – достоверность показателей с контролем в группе активных крыс.
Рп - достоверность показателей с контролем в группе пассивных крыс.
Р – достоверность между группами активных и пассивных крыс на соответствующих этапах исследования.
Двигательная активность, которую оценивали по количеству пересеченных квадратов, у активных и пассивных крыс отличалась специфичностью. Для активных крыс снижение показателей локомоторной активности становилось заметным к 60-м суткам эксперимента, снижаясь к 90-м суткам в 1,32 раза (Р<0,001) относительно исходных параметров. У пассивных крыс, у которых исходная двигательная активность была в 1,8 раза (Р<0,001) меньше, чем у активных крыс, при хронической интоксикации карбофосом наблюдалась прогрессивное снижение локомоторной активности начиная с 30-х суток, достигая к 90-м суткам состояния выраженного подавления движения с эпизодами полного замирания. Для оценки ориентировочно-исследовательской активности определяли суммарное количество вертикальных стоек и заглядываний в отверстия в тесте ОП. У пассивных крыс в исходном состоянии данные показатели в сравнении с активными животными были ниже в 2,79 раза (Р<0,001). На фоне хронической интоксикации карбофосом в обеих группах на 30-е сутки данные показатели существенно не отличались от своих исходных значений. Однако на 60-е сутки у активных крыс ориентировочно-исследовательская активность начала прогрессивно снижаться, уменьшаясь к 90-м суткам в 1,49 раза (РА=0,007) от исходных значений. У группы пассивных крыс показатели на 60-е сутки лишь незначительно были ниже нормы, но к 90-м суткам произошло резкое угнетение ориентировочно-исследовательской активности. Эмоциональный компонент поведения животных, определяемый по количеству актов дефекации, при хронической интоксикации карбофосом проявлял противоположную тенденцию в сравнении с двигательной и исследовательской активностью. У активных крыс наблюдался равномерный прирост данного показателя, увеличиваясь к 90-м суткам хронической интоксикации карбофосом в 1,53 раза (РА=0,12) от уровня исходного контроля, и был ниже относительно пассивных крыс в эти сроки. У пассивных крыс количество актов дефекации значительно увеличивалось уже к 30-м суткам эксперимента в 2,33 раза (Рп=0,018) от исходных значений, и далее этот показатель практически не изменялся до 90-х суток хронической интоксикации карбофосом. Важным компонентом в оценке поведения крыс является груминг, который у взрослой особи занимает значительную часть времени ее бодрствования. Груминг является стресс-зависимой реакцией организма, и его показатели в значительной степени зависят от состояния нервной и эндокринной систем. В проведенном исследовании у активных крыс общая продолжительность и количество актов груминга постепенно возрастало, увеличиваясь к 90-м суткам хронической интоксикации карбофосом в 2,07 раза (Ра=0,018) от исходных показателей, что может свидетельствовать об успешном развитии адаптивных процессов в организме. У пассивных крыс наблюдалась отрицательная динамика изменений количества актов груминга и их продолжительность, что в определенной степени свидетельствует о торможении психической деятельности.
Как видно из данных таблицы 2, хроническая интоксикация карбофосом у активных и пассивных крыс в тесте вынужденного плавания Порсолта вызывает специфические изменения. Для активных крыс продолжительность первого эпизода активного плавания (ЭАП) сохранялась достаточно высокой, снижаясь к 90-м суткам хронической интоксикации карбофосом в 1,44 раза (Ра=0,007) относительно исходных значений. У пассивных крыс исходные показатели ЭАП были ниже в сравнении с активными животными в 1,7 раза (Р<0,001) и в дальнейшем наблюдалась отчетливая тенденция к снижению. ЭАП пассивных крыс к 90-м суткам хронической интоксикации карбофосом уменьшались в 2,06 раза (Рп=0,005) от исходной величины. ЭАП характеризует моторную активность, и снижение данных показателей у активных и пассивных крыс свидетельствует о развитии моторного дефицита, который у пассивных крыс был выражен в значительной степени.
Таблица 2
Показатели поведения активных и пассивных крыс в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» и в тесте Порсолта в динамике хронической интоксикации карбофосом (М± σ)
|
Показатели поведения |
Уровень активности крыс |
|||||||
|
Активные (n = 9) |
Пассивные (n = 12) |
|||||||
|
Значение показателей на этапах исследования |
Значение показателей на этапах исследования |
|||||||
|
Контроль |
30-е сутки |
60-е сутки |
90-е сутки |
Контроль |
30-е сутки |
60-е сутки |
90-е сутки |
|
|
Результаты тестирования в приподнятом крестообразном лабиринте |
||||||||
|
Время пребывания в открытых рукавах (сек.) |
36,7± 12,56 |
40,9± 13,46 РА= 0,65
|
28,3± 14,89 РА= 0,11
|
18,5± 9,59 РА= 0,007
|
21,2± 8,66 Р= 0,005
|
9,3± 4,27 Рп= 0,007 Р< 0,001 |
12,1± 6,93 Рп= 0,058 Р= 0,006 |
20,7± 9,53 Рп= 0,86 Р= 0,59 |
|
Число выходов в открытые пространства (n) |
3,2± 1,23 |
3,4± 1,17 РА= 0,74
|
2,5± 1,18 РА= 0,12
|
2,1± 1,1 РА= 0,028
|
2,2± 1,03 Р= 0,093
|
0,9± 0,74 Рп= 0,018 Р< 0,001 |
1,1± 0,73 Рп= 0,03 Р= 0,013 |
1,4± 0,97 Рп= 0,063 Р= 0,21 |
|
Число свешиваний с открытых рукавов (n) |
4,5± 1,08 |
3,7± 1,25 РА= 0,2
|
3,2± 1,23 РА= 0,08
|
2,7± 1,06 РА= 0,012
|
2,1± 0,74 Р< 0,001 |
2,0± 0,82 Рп= 0,78 Р= 0,005 |
2,3± 0,67 Рп= 0,55 Р=0,12 |
2,4± 0,97 Рп= 0,6 Р=0,47 |
|
Результаты тестирования в тесте Порсолта |
||||||||
|
Продолжительность первого эпизода активного плавания (сек.) |
108,9± 16,34 |
114,4± 20,67 РА= 0,26
|
100,9± 22,34 РА= 0,33
|
75,6± 22,8 РА= 0,007
|
64± 12,2 Р< 0,001
|
69,7± 15,5 Рп= 0,086 Р< 0,001
|
46,7± 15,6 Рп= 0,047 Р< 0,001
|
31,0± 10,5 Рп= 0,005 Р< 0,001
|
|
Суммарная продолжительность эпизодов пассивного («зависания») плавания (сек.) |
124,8± 17,3 |
134,4± 16,2 РА= 0,2
|
142,7± 22,9 РА= 0,14
|
183,9±23,5 РА= 0,005
|
138,6± 27,2 Р= 0,34
|
171,3± 24,7 Рп= 0,059 Р< 0,001
|
210,8±27,2 Рп= 0,005 Р< 0,001
|
259,3± 12,5 Рп= 0,005 Р< 0,001
|
Примечание. РА – достоверность показателей с контролем в группе активных крыс.
Рп - достоверность показателей с контролем в группе пассивных крыс.
Р – достоверность между группами активных и пассивных крыс на соответствующих этапах исследования.
Исследуя суммарную продолжительность эпизодов пассивного плавания (ЭПП), провели оценку уровня депрессивности животных. Для активных и пассивных крыс характерно увеличение данного показателя, который достигает к 90-м суткам максимальных значений. У активных крыс увеличение времени ЭПП до 60-х суток было незначительным и только к 90-м суткам возрастало в 1,47 раза (Ра=0,005). У пассивных крыс время ЭПП начиная с 30-х суток постепенно увеличивалось, возрастая к 90 суткам в 1,87 раза (Рп=0,005) от исходной величины, которая значительно не отличалась от исходной величины активных крыс. Все это свидетельствует о значительном росте депрессивности животных с пассивным типом поведения.
Оценка уровня тревожности животных исследовалась в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт». В данной модели мы не оценивали ориентировочно-исследовательскую и моторную активность, так как был выполнен тест ОП. Полученные результаты свидетельствуют об увеличении тревожности у крыс при хронической интоксикации карбофосом, что проявляется как в сокращении времени пребывания на открытых пространствах лабиринта, так и в количестве выходов на него. Проведенный тест выявил индивидуальные особенности тревожного поведения у активных и пассивных крыс. Из данных таблицы 2 следует, что в исходном состоянии активные крысы в сравнении с пассивными характеризуются пониженной тревожностью. Для активных животных характерно усиление тревожности. Время пребывания на открытых пространствах лабиринта, количество выходов в него, число свешиваний с открытых рукавов уменьшалось в 1,98 (Ра=0,007), в 1,52 (Ра=0,028) и в 1,67 (Ра=0,012) раза соответственно относительно исходных значений на 90-е сутки хронической интоксикации карбофосом. В данном случае такой динамический рост тревожности можно рассматривать как реакции, которые направлены на мобилизацию ресурсов и играют в большей степени адаптивную роль [14]. У пассивных крыс наибольшее падение исследуемых показателей отмечается на 30-е сутки хронической интоксикации карбофосом, уменьшаясь соответственно в 2,28 (Рп=0,007), в 2,44 (Рп=0,018) и в 1,05 (Рп=0,78) раза относительно исходных значений. На 90-е сутки время, проведенное пассивными крысами в открытых рукавах, число выходов в открытые пространства и свешиваний с открытых рукавов, несмотря на высокий уровень депрессивности, увеличивается, приближаясь к исходным значениям. Данные результаты можно рассматривать как нарушение регуляции процессов высшей нервной деятельности на фоне хронической интоксикации карбофосом у пассивных крыс.
Заключение
На основании результатов проведенного исследования установлено, что крысы с разными индивидуально-типологическим статусами не идентичны в поведенческих реакциях при хронической интоксикации карбофосом. Поведенчески активные животные демонстрировали большую устойчивость локомоторной и ориентировочно-исследовательской активности на поздних сроках хронической интоксикации карбофосом, чем пассивные крысы, у которых двигательный дефицит к 90-м суткам приобретал выраженный характер. Повышение уровня эмоционального напряжения и ситуационной тревожности, показатели поведения в тесте Порсолта у активных крыс указывают на адаптивные процессы, формирующиеся при хронической интоксикации карбофосом. Торможение психической деятельности, рост депрессивности крыс, с одной стороны, и увеличение времени пребывания в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта - с другой, свидетельствуют о нарушении регуляторных процессов высшей нервной деятельности у пассивных крыс. Эти различия внутри группы животных, содержащихся в идентичных условиях, могут быть обусловлены генетически детерминированными факторами, связанными с активностью нейромедиаторных систем мозга. С другой стороны, в механизмах индивидуально-типологических особенностей поведения активную роль играют прооксидантные и антиоксидантные системы, формирующие окислительный стресс, который играет важную роль в нейродегенеративных патологиях.