Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

На сегодняшний день сахарный диабет – одна из наиболее актуальных проблем в современной медицине. Быстрое развитие сосудистых осложнений, ранняя инвалидизация, высокая смертность – ключевые характеристики данной патологии, обусловливающие важность обсуждаемой проблемы. В Российской Федерации численность пациентов, состоящих на диспансерном учете с диагнозом «Сахарный диабет 1-го типа», составляет практически 300 тыс. человек, сахарным диабетом 2-го типа страдают более 4 млн человек [1]. По данным различных источников, сахарный диабет приводит к нарушению во всех звеньях свертывающей системы крови, провоцируя развитие тромбозов, что способствует повышению риска развития сердечно-сосудистых осложнений. Гипергликемия, оксидативный стресс и сдвиги рН крови (ацидоз) приводят к изменениям поверхностных структур и мембран клеток, в том числе тромбоцитов, нарушению их функции (гиперактивация), повреждению сосудистой стенки с последующим развитием эндотелиальной дисфункции, формированию DAMPs (damage-associated molecular patterns) в микрососудистом русле, усугубляющей протромботическое состояние [2, 3, 4]. Показано, что у пациентов с сахарным диабетом одновременно усиливается процесс образования тромбина, происходит изменение типа сгустка и снижается фибринолиз [4].

Результаты исследований гемостаза у пациентов, страдающих диабетом, с нашей точки зрения, нельзя считать однозначно объективными, поскольку такие больные параллельно получали инсулинотерапию с целью коррекции дефицита гормона, а также, несомненно, вели неодинаковый образ жизни. Таким образом, исследование системы гемостаза при экспериментальном сахарном диабете у лабораторных животных является более достоверным, так как все животные содержатся в одинаковых условиях и им не проводится лечение. Однако в доступных источниках информации данные об изучении системы регуляции агрегатного состояния крови при аллоксановом диабете малочисленны и ограничиваются коротким периодом наблюдения.

Цель работы – оценить показатели системы гемостаза при моделировании аллоксанового диабета у белых крыс.

Материалы и методы исследования. Исследование проводилось на 60 белых нелинейных крысах-самцах 6–8-месячного возраста массой 240–310 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом академии (ФГБОУ ВО ИвГМА Минздрава России) и проводилось в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных. Моделирование сахарного диабета осуществлялось путем однократного подкожного введения аллоксана моногидрата (фирма ДиаМ) в дозе 135 мг/кг [5]. По данным различных источников, диабетогенной дозой аллоксана принято считать 100–200 мг/кг. Однако однократное введение высоких доз высокотоксично и часто приводит к гибели животного. По данным литературы, доза аллоксана 135 мг/кг приводит развитию специфического повреждения β-клеток поджелудочной железы, что, в свою очередь, способствует развитию клинических (таких как полиурия, полифагия, полидипсия, гипергликемия, потеря массы тела, выпадение шерсти) и патоморфологических признаков сахарного диабета. Оценку показателей гемостаза осуществляли на 3-й (10 крыс – группа 1), 7-й (14 крыс – группа 2), 14-й (13 крыс – группа 3) и 30-й (13 крыс – группа 4) день после введения аллоксана. Для получения контрольных значений показателей было использовано 10 животных (группа 5). Дополнительно 10 крысам был введен 0,9%-ный раствор натрия хлорида с оценкой показателей на 3-й день эксперимента (группа сравнения – группа 6). Полученные результаты в данной группе животных не отличались от показателей контрольной группы (p>0,05).

У экспериментальных животных осуществляли забор крови из левого желудочка под золетиловым наркозом (1–2 мг золетила на 100 г массы животного) шприцом в пробирку с 3,8%-ным раствором цитратом натрия (соотношение по объему – 9:1) для дальнейших исследований. Развитие сахарного диабета подтверждалось патоморфологическим исследованием поджелудочной железы и определением концентрации глюкозы в плазме крови. Для патогистологического исследования поджелудочную железу извлекали и помещали в 10%-ный нейтральный формалин, далее обезвоживали с помощью 99%-ного изопропилового спирта и заливали парафином, выполняли срезы толщиной 5–6 мкм, которые окрашивали гемотоксилином и эозином. Концентрацию глюкозы в плазме крови определяли спектрофотометрическим методом (ООО «Ольвекс диагностикум», Россия). Для исследования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза кровь центрифугировали в течение 15 минут при 1000 оборотов в минуту для получения обогащенной тромбоцитами плазмы. Ее использовали для оценки функции тромбоцитов оптическим турбидиметрическим методом на анализаторе агрегации тромбоцитов АТ-02 (Россия) в присутствии индуктора аденозиндифосфата (5 мкмоль/л, ООО «Технология Стандарт», Россия). Особенностью агрегации тромбоцитов крыс является наличие одной волны, поэтому агрегатограмму оценивали по таким параметрам, как: латентный период (лаг-фаза, с), скорость агрегации на 30-й секунде (%/мин), степень агрегации (%), время агрегации (с), степень дезагрегации (мин), скорость дезагрегации (%/мин). С целью оценки коагуляционного звена гемостаза оставшуюся кровь подвергали центрифугированию 15 минут при 3000 оборотов в минуту для получения бестромбоцитарной плазмы. В дальнейшем, используя диагностические наборы (ООО «Технология-Стандарт», Россия), на полуавтоматическом коагулометре проводили оценку показателей коагуляционного гемостаза – активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (оценка внутреннего механизма свертывания), тромбинового времени (оценка времени образования фибринового сгустка после добавления к плазме тромбина) и протромбинового времени (оценка внешнего механизма свертывания), концентрацию фибриногена. Статистическая обработка результатов осуществлялась стандартным пакетом статистических программ Statistika-6,0. Вариационный анализ полученных результатов проводили в программе Statistika-6,0. Поскольку данные не подчинялись нормальному распределению, для их сравнения использовали критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Летальность животных после введения аллоксана составляла около 30%, в большинстве случаев смерть наступала на 4–5-е сутки после начала эксперимента.

Концентрация глюкозы в крови у контрольных животных составляла 9,35 ммоль/л, на 3-и сутки – 71,98 ммоль/л (р<0,002), на 7-е сутки – 21,68 ммоль/л (р<0,002), на 14-е сутки – 18,78 ммоль/л (р<0,01), на 30-е сутки – 14,84 ммоль/л (р<0,05).

В ходе патоморфологического исследования полученных срезов поджелудочной железы были выявлены гидропическая дистрофия β-клеток островков Лангерганса, а также признаки нарушения кровообращения, что соответствует описанным в литературе признакам аллоксанового диабета [6, 7].

Полученные в ходе исследования данные позволили выявить значительные изменения агрегации тромбоцитов и коагуляционного гемостаза уже через 3 суток после введения аллоксана (табл. 1, 2). При анализе агрегатограммы установлено выраженное снижение всех показателей агрегации тромбоцитов: удлинение лаг-фазы на 76%, снижение скорости агрегации на 96%, степени агрегации на 93% и ее времени на 57%. Дезагрегации в данном случае не наблюдалось. В показателях коагуляционного гемостаза отмечается достоверное увеличение АЧТВ на 90%, тромбинового времени – практически в 2 раза, протромбинового времени – в 1,5 раза, концентрации фибриногена – на 35% по сравнению с контрольными значениями. Таким образом, в этот период наблюдения значительно снижается активность тромбоцитов и возникает состояние тяжелой гипокоагуляции.

Через 7 дней после введения аллоксана отмечаются уменьшение времени достижения максимальной амплитуды на 26% и увеличение скорости дезагрегации на практически в 1,5 раза по сравнению с контрольными значениями. При этом по сравнению со значениями, полученными у предыдущей группы наблюдения, отмечено значимое уменьшение продолжительности латентного периода – на 44%, увеличение скорости агрегации практически в 25 раз, степени агрегации в 19 раз, времени агрегации на 74%. У животных в этот период наблюдения отмечаются изменения показателей свертывания крови: АЧТВ уменьшается на 36% только по сравнению с предыдущей группой наблюдения, тромбиновое время увеличено на 44% по сравнению с контролем и уменьшается в 2 раза относительно 3-х суток наблюдения, протромбиновое время увеличено на 23% (контроль) и уменьшается на 52% относительно предыдущей группы (табл. 1, 2). Концентрация фибриногена увеличена на 47% относительно контроля.

Таблица 1

Динамика показателей агрегации тромбоцитов при аллоксановом диабете у крыс

Примечание: здесь и далее * – (р1) достоверное отличие от контрольных значений (р<0,05); # – (р2) достоверное отличие от предыдущей группы наблюдения (р<0,05).

Таким образом, показатели активности сосудисто-тромбоцитарного гемостаза не только меняются в противоположную сторону относительно предыдущего срока наблюдения, но некоторые даже увеличиваются относительно контроля. Активность коагуляционного гемостаза остается ниже контрольных значений, но выраженность гипокоагуляции по сравнению с предыдущим сроком наблюдения уменьшается.

Таблица 2

Динамика показателей коагуляционного гемостаза при аллоксановом диабете у крыс

Группа	Показатели Me(Q1;Q3)
	АЧТВ, с	Тромбиновое время, с	Протромбиновое время, с	Концентрация фибриногена, г/л
Контроль (n=10)	20,3 (19,7; 23,4)	36,6 (31; 39,8)	24,1 (23,0; 27,7)	1,60 (1,55; 1,70)
Аллоксан 3-и сутки (n=10)	37,5 (33,6; 44,3)* p1=0,01	120,0 (91,8; 120,0)* p1=0,00	65,4 (54,2; 68,0)* p1=0,02	2,20 (2,15; 2,25)* p1=0,00
Аллоксан 7-е сутки (n=14)	24,3 (22,0; 29,2)# p2=0,02	48,5 (47,3; 53,6)*# p1=0,01 p2=0,00	30,9 (28,8; 36,5)*# p1=0,05 p2=0,04	2,32 (1,96; 2,69)* p1=0,02
Аллоксан 14-е сутки (n=13)	24,6 (22,6; 27,1)* p1=0,05	42,7 (41,0; 45,6)* p1=0,04	36,0 (34,2; 38,7)* p1=0,03	2,39 (2,38; 2,52)* p1=0,01
Аллоксан 30-е сутки (n=13)	26,8 (22,4; 30,0)* p1=0,046	51,3 (48,2; 52,1)* p1=0,00	34,9 (33,4; 39,2)* p1=0,00	2,06 (1,91; 2,12)* p1=0,00

Через 14 дней после начала эксперимента при оценке агрегатограммы отмечены уменьшение времени агрегации на 28%, увеличение значений степени дезагрегации в 5,5 раза и скорости дезагрегации почти в 2 раза по сравнению с контрольными показателями. При оценке показателей коагуляционного гемостаза отмечаются следующие нарушения: АЧТВ по сравнению с контрольными значениями больше на 18%, тромбиновое время – на 23%, протромбиновое время – на 44%, концентрация фибриногена – на 44%. По сравнению с предыдущим сроком наблюдения результаты достоверно не отличаются.

Спустя 30 суток после введения аллоксана выявлены удлинение латентной фазы на 46% и снижение скорости агрегации на 68% по сравнению с контрольными значениями. При сравнении полученных данных с результатами предыдущей группы наблюдения также выявлены увеличение продолжительности лаг-фазы на 38%, снижение скорости агрегации на 59% и скорости дезагрегации на 62%. Показатели коагуляционного гемостаза остаются повышенными относительно контрольных значений и не отличаются от предыдущей группы наблюдения: АЧТВ увеличено на 23%, тромбиновое время – на 46%, протромбиновое время – на 43%, а концентрация фибриногена – на 22%. Получается, что в отношении активности тромбоцитов отмечается снижение показателей, а в отношении коагуляционного гемостаза – стабильно сохраняется гипокоагуляция.

Таким образом, полученные результаты подтверждают, что введенная доза аллоксана приводит к развитию экспериментального сахарного диабета, о чем свидетельствуют наличие характерных патоморфологических изменений в поджелудочной железе, а также концентрация глюкозы крови. Результаты нашего исследования выявляют наиболее существенные изменения как активности тромбоцитов, так и коагуляционного гемостаза на 3-и сутки эксперимента. В этот период у животных концентрация глюкозы в крови повышалась примерно в 7 раз по сравнению с контролем, что может оказывать очень выраженное влияние на параметры внутренней среды организма. По нашему мнению, гипергликемия в сочетании с оксидативным стрессом, а также изменение уровня рН крови [2, 3] являются ключевыми факторами формирования нарушений гемостаза при сахарном диабете. В результате гипергликемии происходит накопление конечных продуктов гликирования (AGE), которые стимулируют образование активных форм кислорода путем взаимодействия с собственными рецепторами (RAGE) [4]. Накопление активных форм кислорода способствует их повреждающему действию, стимулирует окислительную модификацию белков, липидов, нуклеиновых кислот, что, в конечном счете, приводит к нарушению их структуры и функции. В условиях гипергликемии и оксидативного стресса в сосудистом русле развивается эндотелиальная дисфункция. Обнажение субэндотелиального слоя в результате повреждения эндотелия при сахарном диабете способствует адгезии, агрегации и гиперактивации тромбоцитов, активации свертывания крови за счет увеличения экспрессии молекул адгезии семейства селектинов и иммуноглобулинов, молекул адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток (ICAM, VCAM, P-селектин); при этом нарушается выработка фактора Виллебранда, простациклина, активатора плазминогена, тромбоглобулина [8, 9].

Основными механизмами изменений в коагуляционном звене гемостаза у экспериментальных животных, с нашей точки зрения, являются нарушения белкового обмена в совокупности с гипергликемией. Повышение концентрации глюкозы в крови приводит к гликированию различных белков, являющихся компонентами свертывающей системы крови: в результате этого происходит изменение заряда белка, его конформации, активного центра и, как следствие, нарушение его функции [10]. В литературе имеются достаточные данные о формировании патологических процессов, помимо поджелудочной железы, в печени (жировая дистрофия, фиброз), в том числе и при аллоксановом диабете в эксперименте [7]. При абсолютной недостаточности инсулина в печени как инсулинзависимом органе нарушается поступление глюкозы в гепатоциты, что, в конечном счете, стимулирует липолиз за счет эффектов контринсулярных гормонов. Увеличение количества свободных жирных кислот (за счет усиления их образования и снижения скорости окисления) на начальных этапах, а затем включение механизмов свободнорадикального окисления жирных кислот и развивающийся оксидативный стресс приводят к разрушению мембран и гибели гепатоцитов. Учитывая наличие патологических изменений в структуре печени, можно сделать вывод о нарушении ее белково-синтетической функции, а именно синтеза белков свертывающей системы крови, что приводит к развитию состояния гипокоагуляции.

Заключение. При аллоксановом диабете у крыс отмечаются существенные нарушения сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. Стимулированная агрегация тромбоцитов меняется в динамике: на 3-и сутки резко снижается, затем возрастает и превышает контрольные значения, к 30-му дню вновь происходит уменьшение показателей ее активности. Показатели как внешнего, так и внутреннего механизмов коагуляционного гемостаза увеличены весь период наблюдения, то есть возникает гипокоагуляция. Наибольшая выраженность нарушений коагуляционного гемостаза отмечается на 3-и сутки – совпадает по времени с максимальными гликемией и снижением активности тромбоцитов.