В последние десятилетия молекулярно-генетические особенности метаболизма витамина D привлекают внимание многих исследователей [1–4]. Библиометрический анализ, проведенный X. Luo с соавторами (2022) с 2012 по 2022 год [1], продемонстрировал ежегодное увеличение количества таких публикаций – со 131 в 2012 г. до 266 в 2021 г., при этом исследования охватывали 72 научных направления, среди которых лидировали Иммунология (337 статей, 20,35%) и Молекулярная биология (179 статей, 10,81%). Следует отметить, что в последние годы количество научных публикаций значительно выросло именно в этих областях, что обусловлено описанием иммуномодулирующей активности витамина D [2].
Цель исследования:получить информацию о возможном участии витамин D-зависимых механизмов в формировании иммунологической толерантности и ее нарушений при синдроме повышенной эпителиальной проницаемости и пищевой аллергии.
Материалы и методы исследования
Поиск научной информации проводили в отечественной (E-Library) и зарубежных базах данных (PubMed, Scopus, Oxford University Press, Springer, Web of Science Core Collection). Ключевые слова: «витамин D», «рецептор витамина D», VDR, «синдром повышенной проницаемости эпителиального барьера», «кишечный барьер», «плотные контакты», «иммунологическая толерантность», «пищевая аллергия» – были подобраны с учетом контент-анализа статей, представленных в международных базах научного цитирования.
Результаты исследования и их обсуждение
Традиционно роль витамина D рассматривалась в регулировании гомеостаза кальция и костного метаболизма [3]. Витамин D, поступающий с пищей или синтезируемый в эпидермисе из 7-дегидрохолестерина, должен быть модифицирован для получения биологически активного метаболита: путем постепенного гидроксилирования ферментом 25-гидроксилазой (CYP2R1) он превращается в 25-гидроксихолекальциферол (25(OH)D), а затем регидроксилируется ферментом 1-α-гидроксилазой (CYP27B1) в 1,25-дигидроксихолекальциферол (1,25(OH)2D), активный метаболит, выполняющий многочисленные функции [5, 6].
Попав в общий кровоток, витамин D связывается со своим сывороточным носителем, белком, связывающим витамин D [4, 7]. Связывающий витамин D белок является генетически старейшим членом семейства альбуминоидов (включая альбумин, α-фетопротеин и афамин, все они участвуют в транспорте жирных кислот или гормонов). Этот белок имеет единственный сайт связывания для всех метаболитов витамина D и имеет высокое сродство к 25OHD и 1,25(OH)2D, тем самым создавая большой пул циркулирующего 25OHD, что предотвращает быстрый дефицит витамина D. Связывающий витамин D белок в высокой степени экспрессируется в печени и экспортируется в кровеносную систему. Связывающий витамин D белок содержит 474 аминокислоты, из которых 16 N-концевых аминокислот функционируют как сигнальный пептид. Он может быть гликозилирован в разной степени в зависимости от генотипа. У человека ген экзона GC/DBP 13 расположен на 4q13.3. Связывающий витамин D белок генетически очень полиморфен с тремя частыми аллелями (DBP/GC 1f, 1s и 2), но в общей сложности известно более 120 различных вариантов, но его последствия для здоровья не изучены. Наиболее распространенные полиморфизмы: rs4588 и rs7041 в гене белка, связывающего витамин D, могут коррелировать с различиями в статусе витамина D в сыворотке крови. Интересно, что ни у мышей с DBP +/–, ни у мышей с DBP–/– не было выявлено каких-либо скелетных аномалий или проблем с балансом кальция и фосфатов [4, 7]. Эти данные свидетельствуют о том, что следовые количества свободных метаболитов и/или повышенная локальная конверсия 25(OH)D в 1,25(OH) 2D достаточны до тех пор, пока достаточное количество субстрата 25(OH)D доступно для хозяина, а функция белка, связывающего витамин D, заключается в поддержании стабильного резервуара циркулирующих внеклеточных метаболитов витамина D.
Большинство биологических действий 1,25(OH)2D опосредуются рецептором витамина D (VDR), членом надсемейства стероидных/тиреоидных рецепторов. VDR функционирует как лиганд-индуцированный фактор транскрипции, регулирующий скорость экспрессии генов, участвующих не только в контроле кальциевого гомеостаза и ремоделирования костей, но также в иммуномодуляции, контроле секреции гормонов, ингибировании роста клеток и индукции клеток.
VDR является членом суперсемейства транскрипционных факторов ядерных рецепторов, которые после связывания с активной формой витамина D и ретиноидным X-рецептором перемещаются в ядро, где могут в течение нескольких часов или дней плейотропно регулировать транскрипцию генов-мишеней, чувствительных к витамину D [8]. Примерно 3% всего генома человека прямо или косвенно регулируются системой витамина D [8], что предполагает участие витамина D и VDR в патогенезе многих заболеваниях. Кроме того, локализация VDR на клеточной мембране способствует быстрому (от нескольких секунд до нескольких минут) негеномному мембрано-опосредованному эффекту активных метаболитов 1,25(OH)2D [9].
Известно, что превращение 25(OH)D в 1,25(OH)2D происходит главным образом в почках с помощью фермента CYP27B1, стимулируемого паратиреоидным гормоном; однако гидроксилирование может осуществляться в других клетках и тканях. Циркулируя в крови, 1,25(OH)2D связывается со специфическим рецептором витамина D (VDR), который был обнаружен во многих тканях организма: в костях (остеобласты и хондроциты), мышцах, жировой ткани, коже, эпителии, почках, поджелудочной железе, гипофизе, а также в иммунных клетках (Т- и В-лимфоцитах, моноцитах, натуральных киллерах и антигенпрезентирующих клетках (АПК)) [10]. Примечательно, что наиболее сильно индуцированный ген-мишень 1,25D кодирует именно CYP24A1 – фермент, который инициирует катаболизм как 25D, так и 1,25D, и, таким образом, действует как физиологическая петля отрицательной обратной связи. Метаболиты витамина D обладают антипролиферативным, регуляторным и противовоспалительным действием, участвуют в защитных процессах против индуцированного повреждения и окислительного стресса [11] и индуцируют клеточно-специфические противоопухолевые эффекты [12].
Смена парадигмы в восприятии физиологической роли витамина D началась с открытия того, что CYP27B1 широко экспрессируется в тканях, которые не связаны с гомеостазом кальция [11]. Точно так же широко экспрессируется рецептор витамина D (VDR) [10]; его широкая экспрессия наряду с выражением CYP27B1 сильно затрагивает физиологическую роль локально продуцируемого 1,25D, действующего внутрикринным или паракринным образом. Важно отметить, что, в отличие от почечной 1α-гидроксилазы, активность CYP27B1 в этих клетках регулируется иммунными входами, такими как ИФН-γ, а также агонистами PRR, такими как TLR. Наиболее важный вывод, свидетельствующий о том, что передача сигналов 1,25D способствует врожденному иммунитету, был сделан в результате исследования, в котором исследователи стимулировали макрофаги человека липопептидным лигандом 19-кДа гетеродимеров TLR1 и TLR2 (TLR2/1), что приводило к индукции экспрессии VDR и CYP27B1 и усилению эндогенной продукции 1,25D из циркулирующего 25D [6]. Аналогичным образом, запуск рецепторов TLR4 через передачу сигналов липополисахаридов (ЛПС) также повышал экспрессию CYP27B1 [12].
В последние годы доказано, что влияние витамина D на функцию иммунной системы многогранно [1, 2, 4], отсутствие механизмов обратной связи в иммунных клетках позволяет генерировать высокие концентрации кальцитриола, необходимые для иммунной регуляции. Так, витамин D препятствует пролиферации и дифференцировке В-клеток, секреции иммуноглобулинов [13]. Он ингибирует пролиферацию Т-клеток и способствует индукции Т-регуляторных клеток [14]. В результате происходят угнетение продукции воспалительных цитокинов, таких как IL-17 и IL-21, и индукция противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10 и др. [15]. Это приводит к сбалансированному Th1/Th2 ответу. Моноцитарная продукция воспалительных цитокинов, включая IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 и TNFα, ингибируется в присутствии витамина D [16]. Доказано, что витамин D активирует NK-клетки и NKT-клетки, модулируя секрецию цитокинов, таких как IFN-γ и IL-4, с одновременным подавлением активации макрофагов. Кроме этого, витамин D ингибирует выработку провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-12 и TNF-α) моноцитами, сдерживает дифференцировку и созревание дендритных клеток со сниженной экспрессией молекул МНС класса II, костимулирующих молекул и IL-12, важных для аутотолерантности [16].
Исследования последних лет установили, что дендритные клетки могут использовать витамин D для программирования Т-клеток. Более того, 1,25(OH)2D также может напрямую взаимодействовать с дендритными клетками и влиять на их миграцию, способность инструктировать Т-клетки и, как следствие, инициировать, регулировать или подавлять иммунные ответы [16].
Эти результаты послужили основой для проведения дальнейших клинических и эпидемиологических исследований, в которых изучалась связь между витамином D и распространенностью и тяжестью многих аутоиммунных и онкологических заболеваний, воспалительных заболеваний кишечника, а также аллергических заболеваний [1, 5]. Проведенные исследования также показали, что витамин D играет важную роль и в регуляции проницаемости кишечного барьера, что вызывает особый интерес в контексте формирования пищевой толерантности и пищевой аллергии.
Недавно описанная «гипотеза эпителиального барьера» подчеркивает, что факторы окружающей среды часто оказывают пагубное воздействие на эпителиальные барьеры кожи, дыхательных путей и слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта [17]. Существуют неоспоримые сходства в структуре и функции различных эпителиальных барьеров, обеспечивающие единые патогенетические механизмы формирования атопических расстройств, включая атопический дерматит (АтД), аллергический ринит (АР), бронхиальную астму (БА), эозинофильный эзофагит (ЭоЭ) и пищевую аллергию (ПА) в результате взаимодействия между поврежденным эпителием и иммунными клетками [5, 8, 18]. Повышение проницаемости кишечного барьера играет особую роль и влияет на иммунитет дистальных органов, в том числе респираторной системы, способствуя формированию коморбидных заболеваний и усиливая модулирование иммунных реакций самого желудочно-кишечного тракта [19].
Кишечный барьер должен уравновешивать противоположные функции – обеспечивать избирательный транспорт питательных веществ, а также формировать целостный барьер, который ограничивает свободный обмен других веществ через парацеллюлярное пространство. Решающим фактором для реализации этих свойств является состоятельность апикального соединительного комплекса. Эта структура, впервые описанная в 1963 г. [20], состоит из трех соединений, которые известны как плотное соединение (zonula occludens), сращенное соединение (zonula Adidas) и десмосома (слипающееся пятно). Плотное соединение (плотные контакты, Tight junctions, TJ) образуются рядом белков, включая клаудины, окклюдин, соединительные молекулы адгезии (JAM), трицеллюлин и белки цитоплазматических бляшек, например белки zonula occludens (ZO), такие как ZO-1, ZO-2 и ZO-3 [21]. Эти белки взаимодействуют с актиновым цитоскелетом, что имеет решающее значение для поддержания структуры плотных контактов и целостности эпителиального барьера. В ряде исследований выявили нарушения состояния плотных контактов кишечника и дисрегуляцию компонентов TJ–комплекса, включая работу окклюдинов, клаудинов и молекул адгезии при различных заболеваниях кишечника [21]. В экспериментальных моделях на животных, а также в клинических исследованиях пищевая аллергия описывалась ка процесс, связанный с явным нарушением функции кишечного барьера и повышенной кишечной проницаемостью [21].
Исследования последних лет доказали роль витамина D в индукции экспрессии окклюдина, ZO-1, ZO-2 и трицеллюлина. Так, в экспериментальном исследовании [20] эпителиальные клетки имели повышенную трансэпителиальную резистентность, пониженную проницаемость для инулина и повышенный уровень окклюдина при культивировании с 25(OH)D3 и 1,25(OH)2D3. Авторы продемонстрировали, что обработка 1,25(OH)2D3 сама по себе снижала трансэпителиальную резистентность в культивируемых эпителиальных клетках кишечника и защищала клетки от повышения проницаемости, вызванной декстрансульфатом натрия (DSS) in vitro.
Другими исследователями было продемонстрировано, что белки TJ, такие как ZO-1, активируются в энтероцитах с помощью 1,25(OH)2D3. В экспериментальной модели колита мыши, лишенные VDR, были более восприимчивы к повреждению по сравнению с мышами VDR+ [22]. Согласно генетическим исследованиям, VDR является транскрипционным фактором, регулирующим гены многих белков TJ, включая клаудин-2, -5, -12 и -15 в эпителиальных клетках кишечника [22]. Например, последовательность функционального элемента ответа на витамин D (AGATAACAAAGGTCA) идентифицирована в промоторе гена клаудина-5. Делеция VDR снижала уровни мРНК и белка клаудина-5, а активация VDR увеличивала экспрессию клаудина-5 [23]. Эти данные указывают на то, что VDR может играть критическую роль в гомеостазе слизистого барьера, сохраняя целостность соединительных комплексов и способность к заживлению эпителия толстой кишки [24].
Передача сигналов VDR также очень важна для регуляции других путей пролиферации и противовоспалительных реакций в кишечном барьере [25]. Гены-мишени VDR включают гены предшественника антимикробного пептида (AMP) кателицидина (LL-37), β-дефензина, регулятора аутофагии ATG16L1, и регулятора пролиферации Axin1, в дополнение к генам клаудина-2, -5, -12 и -15 [26].
Вполне возможно, что эпителиальный VDR может регулировать воспаление кишечника, регулируя выработку антимикробных пептидов в колоноцитах и энтероцитах. Кроме того, эпителиальная передача сигналов VDR может также регулировать аутофагию – еще одно молекулярное событие, которое связано с нарушением кишечного барьера и развитием хронического аллергического воспаления [27]. Действительно, известно, что сверхэкспрессия VDR также ингибирует выработку эпителиальных воспалительных цитокинов в моделях воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), что может оказывать значительное влияние на течение воспаления толстой кишки [5]. Воспалительные цитокины, продуцируемые эпителиальными клетками, оказывают аутокринное и паракринное действие в толстой кишке. VDR физически взаимодействует с NF-κBp65 и транскрипционно регулирует IκBa, выполняя противовоспалительную функцию и подавляя воспалительные цитокины [23].
W. Liu с соавторами (2013) в своем исследовании показали, что эпителиальная передача сигналов VDR ингибирует апоптоз эпителиальных клеток кишечника, подавляя белок PUMA (p53 Upregulated Modulator Of Apoptosis, про-апоптотический протеин из семейства Bcl-2) [5]. Известно, что повышенный апоптоз эпителия кишечника нарушает барьер слизистой оболочки и увеличивает ее проницаемость. В экспериментальных моделях колита у мышей, лишенных VDR, был обнаружен обширный апоптоз колоноцитов, сопровождающийся надежной индукцией PUMA и активацией каспазы 3, но эпителиальная экспрессия hVDR заметно подавляла апрегуляцию PUMA и активацию каспазы 3, что приводило к снижению апоптоза IEC [5]. Поскольку PUMA является ключевым индуктором апоптоза эпителия кишечника, был исследован молекулярный механизм, посредством которого 1,25 (ОН)2D3-VDR подавляет его экспрессию. В клетках HCT116 1,25 (ОН)2D3 ингибировал TNF-α-индуцированную активность белка PUMA и его промотора, ослаблял индуцированную IKKβ экспрессию белка PUMA, ингибировал активность IKK-киназы, индуцированной TNF-α, и нарушал TNF-α-индуцированное связывание p65 с сайтом PUMA κB. Важно отметить, что экспрессия hVDR в эпителиальных клетках кишечника существенно ингибировала активность киназы IKK в слизистой оболочке толстой кишки у мышей, а также ингибировала индукцию PUMA и активацию каспазы 3. Эти данные подтверждают, что передача сигналов VDR подавляет эпителиальную активность NF-κB in vivo, обеспечивая механистическое понимание функции эпителиальной передачи сигналов VDR в гомеостазе кишечного барьера.
Заключение
Таким образом, не вызывают сомнения участие витамина D в регуляции проницаемости кишечного барьера и его роль в поддержании гомеостаза кишечника. В дополнение к установленной VDR-зависимой регуляции плотных соединений большое значение для формирования иммунологической толерантности имеет противовоспалительная активность VDR. Потенциальные противовоспалительные и иммунорегуляторные VDR-зависимые механизмы требуют дальнейшего изучения, в том числе при нарушении формирования иммунологической толерантности и развитии аллергических заболеваний. Большинство представленных исследований были проведены на клеточных линиях в эксперименте на животных. Необходимы крупномасштабные и хорошо спланированные рандомизированные клинические исследования, чтобы подтвердить эти результаты in vivo, исследовать оптимальный режим приема витамина D и определить пациентов, которые получат наибольшую пользу от его добавок. Эти данные впоследствии могут быть использованы для разработки диагностических и терапевтических стратегий, использующих белки TJ в качестве клинических биомаркеров для раннего выявления аллергических заболеваний и формирования групп риска, а витамин D – для профилактики и лечения аллергических заболеваний.