Известно, что многие критические и терминальные для организма состояния сопровождаются нарушением системы регуляции агрегатного состояния крови [1]. При этом давно доказано, что все подобные ситуации вызывают возникновение стресс-реакции, активации стресс-реализующих механизмов и, следовательно, способствуют усилению активности симпатоадреналовой системы, что в конечном итоге приводит к значительному повышению уровня катехоламинов в крови [2]. Общепринятым является представление, что катехоламины (адреналин, норадреналин) повышают активность сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. Описан ряд механизмов влияния фармакопейного препарата адреналина – эпинефрина на функцию тромбоцитов. Существует путь активации этих постклеточных структур через каскад арахидоновой кислоты, а также через стимуляцию альфа-2-адренорецепторов, ингибирование аденилатциклазы и повышение проницаемости для ионов кальция [3]. Также эпинефрин усиливает способность к взаимодействию тромбоцитов – процессы адгезии и агрегации, увеличивает образование микроагрегатов [4]. Важным механизмом активации тромбоцитов является выделение на их поверхности фосфотидилсерина [5]. Адреналин повышает содержание фосфотидилсерина, в результате чего на поверхности этих форменных элементов увеличивается концентрация трансмембранных протеинов внешнего слоя, активирующих факторы свертывания. Таким путем осуществляется сопряжение сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза. Активность образования тромбина, концентрация фактора Виллебранда и фибриногена в этих условиях также повышается, возрастает содержание маркеров взаимодействия тромбин-фибриноген, снижается толерантность к тромбину [6, 7]. Блокада адренорецепторов значительно снижает выраженность нарушений коагуляционного гемостаза, что свидетельствует о преимущественной роли тромбоцитов и сосудистых нарушений в реакции системы гемостаза на катехоламины [8]. Возникающая в условиях гиперкатехоламинемии активация тромбоцитов и факторов коагуляции может приводить к диссеминированному микросвертыванию крови, активации и истощению плазменных протеолитических систем, повышенному потреблению физиологических антикоагулянтов и факторов свертывания крови, то есть формированию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдром) [1]. Однако комплексная оценка свертывающей и противосвертывающей систем в динамике развития гиперкатехоламинемии в литературе не описана. Наши более ранние исследования выявили существенные изменения активности тромбоцитов в динамике гиперкатехоламинемии [9]. Также была проведена инфракрасная спектроскопия фибриновых сгустков, полученных при свертывании крови этих животных [10].
Цель – изучить динамику изменений показателей свертывающей, противосвертывающей систем и процесса фибринолиза при гиперкатехоламинемии у крыс.
Материал и методы исследования. Эксперимент выполнялся на 78 белых нелинейных крысах-самцах массой 240–300 г, находившихся в стандартных условиях вивария с соблюдением основных зоогигиенических требований. Все манипуляции проводились в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS № 123, Страсбург, 1986 г.). На проведение исследования было получено разрешение этического комитета ФГБОУ ВО ИвГМА Минздрава России (Протокол № 6 от 26.05.2021 г.). Животные были разделены на три группы: основную (n=40), которой вводились адреналин, раствор для инъекций в ампулах, 1 мг/мл («Московский эндокринный завод ФГУП», Россия) в дозе 2 мг/кг подкожно с последующим забором крови из левого желудочка через 15 минут, 30 минут, 1 час, 24 часа, 72 часа; группу сравнения (n=30), которой вводился эквивалентный объем физиологического раствора подкожно с последующим забором крови из левого желудочка через 15 минут, 30 минут, 1 час, 24 часа, 72 часа, и контрольную (n=8) – интактные животные. Используемая доза адреналина, по данным наших патоморфологических исследований, приводит к развитию катехоламинового повреждения миокарда и отеку легких [11]. Забор крови осуществляли после наркотизации раствором золетила (1–2 мг на 100 г массы). Полученную кровь центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин с целью получения плазмы, бедной тромбоцитами. Далее оценивали показатели системы гемостаза: частично активированное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время, тромбиновое время и концентрацию фибриногена – оптическим методом на полуавтоматическом коагулометре ECL 105 («Эрба Лахема», Чехия) с помощью диагностических наборов (ООО «Технология-Стандарт», Россия); антисвертывающей системы: антитромбин III и гепарин, а также системы фибринолиза: плазминоген и D-димер – фотометрически на спектрофлуориметре СМ 2203 (SOLAR, Беларусь) с помощью диагностических наборов (НПО «РЕНАМ», ООО «Технология-Стандарт», Россия). Вариационный анализ полученных данных осуществляли с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.). Значения величин представляли в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартиля (Q1; Q3). Для обработки данных использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. Результаты, полученные у животных в группе сравнения и в контроле, достоверно не отличались. Через 15 минут после введения адреналина у животных наблюдаются увеличение протромбинового времени на 72%, АЧТВ – на 58%, тромбинового времени – на 37%, снижение активности антитромбина III на 12% и повышение уровня гепарина в 13,5 раза (табл. 1, 2). По данным литературы, концентрация адреналина в крови при подкожном введении повышается уже на 3–5-й минуте [12], происходят активация тромбоцитов и факторов свертывания, интенсивное их расходование, что к 15-й минуте проявляется значительным нарушением внешнего и внутреннего механизмов гемостаза. Сложившийся дефицит антитромбина III может быть обусловлен интенсивным расходом данного естественного антикоагулянта в ответ на имеющуюся в этот момент гиперкоагуляцию, а повышение уровня гепарина обусловлено дегрануляцией тучных клеток для снижения активности факторов свертывания.
Таблица 1
Динамика показателей коагуляционного гемостаза при гиперкатехоламинемии у крыс (Me (Q1; Q3))
|
Группа |
Показатели |
|||
|
АЧТВ, с |
Протромбиновое время, с |
Тромбиновое время, с |
Фибриноген, г/л |
|
|
Контроль |
20,3 |
24,1 |
36,6 |
1,60 |
|
Адреналин 15 минут |
32,0 |
41,5 |
50,0 |
1,93 |
|
Адреналин 30 минут |
32,6 |
39,8 |
54,3 |
1,77 |
|
Адреналин 1 час |
24,4 |
36,0 |
26,6 |
1,64 |
|
Адреналин 24 часа |
32,0 |
45,8 |
29,1 |
1,67 |
|
Адреналин 72 часа |
24,2 |
27,2 |
28,6 |
1,78 р1=0,454 р2=0,940 |
Примечание: здесь и далее * – достоверное отличие от контрольных значений (р1<0,05); # – достоверное отличие от предыдущего срока наблюдения (р2<0,05).
Через 30 минут возникшие нарушения показателей коагуляционного гемостаза сохраняются: отмечается увеличение протромбинового времени на 65%, АЧТВ на 61% и тромбинового времени на 48% по сравнению с контрольными значениями. При этом активность антитромбина III повышается относительно предыдущего срока наблюдения на 19% и возвращается к уровню контроля. Также относительно контрольных значений наблюдается повышение уровня гепарина в 9,5 раза, активности плазминогена на 7% и концентрации D-димера более чем в 2 раза. Изменения, скорее всего, связаны с избыточным расходованием факторов, отвечающих не только за внешний, но и за внутренний механизм коагуляционного гемостаза. Повышение активности антитромбина III может быть связано с его выходом из печени и эндотелия сосудов, а повышение гепарина – с продолжающейся дегрануляцией тучных клеток, что имеет уже не компенсаторное, а патогенетическое значение. Помимо этого, к данному сроку наблюдения происходит активация системы фибринолиза: в ответ на формирующиеся в организме фибриновые тромбы из печени, вероятно, выходит плазминоген для их дальнейшего лизиса посредством плазмина, а сопутствующее повышение уровня D-димера связано с деградацией образовавшегося фибрина под влиянием этого фермента. Получается, что в этот период времени появляются классические признаки ДВС-синдрома, стадия – коагулопатия потребления.
Таблица 2
Динамика показателей противосвертывающей системы и системы фибринолиза при гиперкатехоламинемии у крыс (Me (Q1; Q3))
|
Группа |
Показатели |
|||
|
Антитромбин III, % |
Гепарин, МЕ/мл |
Плазминоген, % |
D-димер, нг/мл |
|
|
Контроль |
82,2 |
0,004 |
54,6 |
88,0 |
|
Адреналин 15 минут |
72,9 |
0,054 |
53,2 |
103,5 |
|
Адреналин 30 минут |
86,7 |
0,038 |
58,5 |
226,0 |
|
Адреналин 1 час |
58,8 |
0,221 |
63,0 |
399,0 |
|
Адреналин 24 часа |
74,3 |
0,087 |
50,0 |
142,5 |
|
Адреналин 72 часа |
80,2 |
0,033 |
49,1 |
134,0 р1=0,021 р2=0,431 |
Через 60 минут после введения адреналина АЧТВ и тромбиновое время укорачиваются относительно предыдущего срока наблюдения на 25% и 49% соответственно, протромбиновое время и концентрация фибриногена не меняются. В противосвертывающей системе наблюдаются снижение активности антитромбина III (на 30 и 33% соответственно) и повышение уровня гепарина (в 55 и 6 раз соответственно) по сравнению с контрольными значениями и с предыдущим сроком наблюдения. Относительно группы контроля остается достоверно выше уровень плазминогена на 15% и D-димера – более чем в 4 раза. На 60-й минуте после введения адреналина может произойти дополнительный выброс факторов свертывания из печени, что частично компенсирует гипокоагуляцию. Также происходят максимальные интенсивное потребление антитромбина III и усиленная дегрануляция тучных клеток, на фоне этого параллельно продолжается разрушение фибриновых тромбов с максимальным повышением значений D-димера, то есть сохраняются признаки ДВС-синдрома.
Через 24 часа наблюдается значительное повышение АЧТВ – на 57%, протромбинового времени – на 90% по сравнению с контролем. Концентрация гепарина снижается относительно предыдущего срока наблюдения на 60% и относительно контроля – в 21 раз. Содержание D-димера по сравнению с контрольными значениями сохраняется повышенным в 2 раза. Таким образом, видно, что через 24 часа сохраняются признаки тяжелой гипокоагуляции. Выделение гепарина уменьшается, вероятно, за счет снижения его резервов, что имеет компенсаторное значение. Система фибринолиза сохраняет свою активность. Следовательно, продолжается развитие ДВС-синдрома – формируется стадия гипокоагуляции и активации фибринолиза. В этот период наблюдения D-димер, который образовался в результате острой гиперкатехоламинемии, уже полностью выводится из организма, так как период его выведения составляет около 8 часов. Образование новых порций продуктов разрушения фибрина, вероятно, связано с действием эндогенных стресс-реализующих систем [13].
Через 72 часа после введения адреналина АЧТВ остается повышенным всего на 19%, а протромбиновое время достоверно не отличается от контрольных значений. Концентрация D-димера повышена относительно контрольных значений, но только в 1,5 раза, то есть наблюдается устойчивая тенденция к восстановлению показателей коагуляционного гемостаза, противосвертывающей системы и системы фибринолиза, однако в организме продолжается лизис имеющихся фибриновых тромбов.
Заключение. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что при состояниях, сопровождающихся гиперкатехоламинемией, патогенез нарушений системы регуляции агрегатного состояния крови связан с возникновением синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания. В описанном эксперименте развитие этого синдрома протекало благоприятно: животные не погибали, состояние свертывающей и противосвертывающей систем компенсировалось самостоятельно. Однако при гиперкатехоламинемии на фоне тяжелых заболеваний подобные изменения системы гемостаза могут значительно утяжелять состояние больных и повышать риск развития осложнений и летальных исходов.