В последние десятилетия хронические заболевания печени вызывают огромный интерес медиков всего мира. Печень является уникальным органом, выполняющим большое количество разнообразных функций. Это обусловлено особенностями ее строения и наличием многообразных мультиферментных комплексов. Различные заболевания сопровождаются негативным влиянием на этот орган, вызывая развитие стеатоза, приводящего к воспалительным процессам, разрушению клеток печени и развитию фиброза. Фиброз печени характеризуется избыточным накоплением межклеточного матрикса соединительной ткани (коллагена, неколлагеновых белков, гликозаминогликанов, протеогликанов), который способен быстро менять свой состав под действием повреждающих факторов. Одним из предикторов развития такой ситуации является сахарный диабет. Во-первых, дефицит инсулина сопровождается дефицитом глюкозы в клетках, что сопровождается активацией липолиза, поступлением свободных жирных кислот в клетки печени, снижением скорости выведения липопротеинов из гепатоцитов и, как следствие, накоплением липидов в гепатоцитах. Во-вторых, длительная гипергликемия при сахарном диабете является прооксидантным фактором и приводит к развитию оксидативного стресса, вызывающего повреждение мембран и разрушение гепатоцитов [1, 2]. По данным некоторых исследователей, фиброз печени может быть обратимым процессом при условии своевременного устранения этиологического и патогенетического факторов [3, 4]. Но исследований, посвященных особенностям развития фиброза печени при сахарном диабете, немного и выводы не всегда однозначны. Кроме того, продолжается поиск лекарственных препаратов, направленных на снижение скорости фиброзирования печени и оказывающих этиотропное, антиоксидантное, противовоспалительное, цитопротективное действия. В данной работе авторы использовали даларгин, который является аналогом лей-энкефалина, но с более высокой устойчивостью к протеолитическим ферментам. Данный препарат создан в 1978 году и включает в себя определенную последовательность аминокислот, характерную для большинства опиоидов, действующих через δ- и μ-опиатные рецепторы. Но, в отличие от природных центральных опиатов, даларгин не проникает через гематоэнцефалический барьер и в проведенных экспериментах не вызывал развития толерантности и физической зависимости. Произведенная замена аминокислоты глицин во втором положении аминокислотной цепи лей-энкефалина на аминокислоту D-аланин увеличила стабильность пептида в организме, обеспечивая устойчивость к действию эндопептидаз. Он прошел все стадии доклинического и клинического исследования и был разрешен к клиническому применению для лечения язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки с целью ускорения процессов регенерации тканей. Доказано, что симпатическая нервная система активирует репаративную регенерацию разных органов и тканей, включая печень. Даларгин оказывает модулирующие влияние на активность симпатоадреналовой системы в различных стрессовых ситуациях за счет подавления активности ферментов ДОФА-декарбоксилазы и, в меньшей степени, дофамин-β-гидроксилазы, а также уменьшения высвобождения норадреналина из симпатических окончаний [5]. Это приводит к сохранению депо катехоламинов в симпатических окончаниях и последующей симпатической (норадренергической) стимуляции репаративной регенерации. Доказана способность даларгина снижать генерацию активных форма кислорода и поддерживать уровень низкомолекулярных антиоксидантов, оказывать иммуномодулирующее и гипотензивное действия. Дальнейшие исследования механизмов действия даларгина позволили использовать его для лечения острых и хронических панкреатитов, панкреонекроза, инфаркта миокарда [6, 7], так как он обладает широким спектром биологической активности и действует на различные звенья патологического процесса, имея при этом специфическую направленность. Учитывая все вышесказанное, авторы исследовали влияние даларгина на метаболизм коллагена в печени при аллоксановом диабете, так как таких данных в литературе недостаточно.
Цель исследования: изучить влияние даларгина на некоторые показатели метаболизма коллагена печени экспериментальных животных в условиях аллоксанового диабета.
Материал и методы исследования. Для участия в эксперименте авторы отобрали 60 белых беспородных крыс-самцов массой 170–230 г. Для развития сахарного диабета использовали аллоксана тетрагидрата (мезоксалмочевина, производство «Fluka Chemika», Швеция), применяя однократное подкожное введение в дозировке 170 мг/кг массы животного. Аллоксан является структурным аналогом глюкозы, поэтому может связываться с глюкозными транспортерами и накапливаться в бета-клетках поджелудочной железы, вызывая в них генерацию активных форм кислорода в циклической реакции с диалуроновой кислотой [8]. Это вызывает повреждение молекул нуклеиновых кислот в бета-клетках, нарушение синтеза и секреции инсулина, что приводит к дефициту инсулина, нарушению поступления глюкозы в клетки и, как следствие, развитию хронической гипергликемии. После введения аллоксана экспериментальные животные находились на обычном рационе вивария со свободным доступом к воде. Внутримышечные инъекции даларгина (Минздравмедпром России, НПО «Биомед») проводили через каждые 72 часа в течение 30 дней в дозе 100 мкг/кг массы животного. Контрольную группу составили крысы с подкожным введением 0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl через каждые 72 часа в течение 30 дней [9]. Животных выводили из эксперимента на 10-й и 30-й дни, соблюдая гуманное отношение к животным. У экспериментальных животных в крови определяли уровень глюкозы и гликозилированного гемоглобина с помощью стандартных наборов «Глюкоза GOD-PAP» (НПФ АБРИС+) и Lachema (Словакия) соответственно. В гомогенатах центральной доли печени исследовали количество свободного гидроксипролина с использованием парадиметиламинобензальдегида [10]. Содержание суммарного коллагена оценивали по уровню свободного гидроксипролина, образовавшегося в результате его гидролиза в ампулах в течение 6 часов при 106°С в 6,0 н растворе соляной кислоты. Определение нейтральносолерастворимой фракции коллагена проводили по уровню свободного гидроксипролина после экстрагирования 0,2М NaCl при t=40 в течение 24 часов и дальнейшего гидролиза в ампулах в течение 6 часов при 106°С в 6,0 н растворе соляной кислоты [11]. Количество изучаемых показателей в плазме крови выражали: глюкоза – ммоль/л, гликозилированный гемоглобин – в ммоль/г гемоглобина; в гомогенатах печени – все показатели в ммолях гидроксипролина на 1 кг сухой ткани (ммоль/кг). Все полученные результаты эксперимента авторы обработали с помощью программы Statistica 6.1 (StatSoft), применяя непараметрические методы, и представили их в виде медиан и интерквартильных интервалов. При межгрупповом сравнении полученных данных для анализа различий по количественным параметрам использовали U-критерий Манна–Уитни [12].
Результаты исследования и их обсуждение. О формировании аллоксанового диабета у экспериментальных животных судили по развитию гипергликемии и увеличению концентрации гликозилированного гемоглобина в крови. Содержание глюкозы в крови на 10-й и 30-й дни опыта превышало контроль на 147% (р<0,01) и 216% (р<0,001) соответственно (табл. 1). Количество гликозилированного гемоглобина также было повышенным в течение всего периода наблюдений: на 139,9% (р<0,001) к 10-му дню и на 271,7% (р<0,001) к 30-му дню, что свидетельствует о длительности гипергликемии (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови крыс с аллоксановым диабетом, протекающим на фоне системного введения даларгина (Медиана [25; 75%])
|
Показатели |
Контроль (n=20) |
Дни эксперимента |
|
|
10 (n=10/10) |
30 (n=10/10) |
||
|
Глюкоза, ммоль/л |
5,34 [5,15; 5,5] |
13,2 [11,96; 13,95]** 5,74 [5,38; 6,17] ## |
16,92 [15,14; 20,13]*** 5,5 [5,25; 5,65] ### |
|
HbAlc, % от общего Hb |
5,73 [5,48; 5,93] |
13,75 [12,44; 14,7] *** 6,12 [5,9; 6,73] ### |
21,3 [19,87; 25,1] *** 10,0 [9,77; 10,25]*** ### |
Примечание. В числителе – показатели в крови крыс с аллоксановым диабетом, в знаменателе – с аллоксановым диабетом на фоне введения даларгина Достоверность различий с контролем (*) и между группами животных «Аллоксановый диабет» и «Аллоксановый диабет на фоне введения даларгина» (#): *, # – р<0,05; **, ## – р<0,01; ***, ### – р<0,001. HbAlc – гликозилированный гемоглобин.
Об обмене коллагена при аллоксановом диабете авторы судили по нескольким показателям: свободный гидроксипролин, нейтральносолерастворимая фракция коллагена, суммарный коллаген. Свободный гидроксипролин не включается в процессы синтеза коллагена, поэтому его количество в гомогенатах печени мы рассматривали как показатель скорости катаболизма коллагеновых белков. На разных этапах развития соединительной ткани в ней образуются различные по растворимости формы коллагена. В работе авторы определяли количество нейтральносолерастворимой фракции коллагена в качестве показателя скорости синтеза данного белка, так как именно эта фракция содержит вновь образованные молекулы, непрочно связанные с надмолекулярными элементами. Суммарный коллаген отражает общую направленность метаболических процессов и является количественной характеристикой интенсивности накопления данного белка в печени.
При введении аллоксана в гомогенатах печени к 10-му дню опыта наблюдалось увеличение нейтральносолерастворимой фракции коллагена на 250% (р<0,01), а содержание суммарного коллагена – на 32,4% (р<0,001). К концу эксперимента количество суммарного коллагена превышало данные интактных животных уже на 50% (р<0,001), тогда как количество нейтральносолерастворимой фракции коллагена достоверно не отличалось от контроля. При этом в течение всего периода эксперимента авторы не наблюдали достоверных изменений уровня свободного гидроксипролина в гомогенатах печени (табл. 2).
Таблица 2
Показатели обмена коллагена в печени крыс с аллоксановым диабетом, протекающим на фоне системного введения даларгина (Медиана [25%; 75%])
|
Показатели |
Контроль (n=20) |
Дни эксперимента |
|
|
10 (n=10/10) |
30 (n=10/10) |
||
|
Суммарный коллаген, ммоль/кг |
24,4 [21,35; 25,01] |
32,04 [27,46; 33,56]** 33,56 [31,73; 33,56]*** |
36,61 [33,56; 36,61]*** 21,35 [21,35; 24,4] ### |
|
Свободный гидроксипролин, ммоль/кг |
0,61 [0,41; 0,81] |
0,61 [0,61; 0,81] 1,22 [1,22; 1,22] *** ## |
0,81 [0,61; 0,81] 1,02 [1,017; 1,62]*** ## |
|
Нейтральносолерастворимая фракция коллагена, ммоль/кг |
0,12 [0,12; 0,36] |
0,42 [0,36; 0,48]** 0,12 [0,12; 0,12] ## |
0,12 [0,12; 0,24] 0,48 [0,36; 0,61]*** ### |
Примечание. В числителе – показатели метаболизма коллагена в печени крыс с аллоксановым диабетом, в знаменателе – с аллоксановым диабетом на фоне введения даларгина Достоверность различий с контролем (*) и между группами животных «Аллоксановый диабет» и «Аллоксановый диабет на фоне введения даларгина» (#): *, # – р<0,05; **, ## – р<0,01; ***, ### – р<0,001.
Авторы предположили несколько механизмов развития подобной ситуации. Синтез компонентов межклеточного матрикса происходит в основном в звездчатых клетках печени и портальных фибробластах. При сахарном диабете, который является сильным окислительным стрессом для организма животного, происходит активация перекисного окисления мембранных молекул, нарушается целостность мембран, повышается их проницаемость, изменяются структура и функции различных ферментов, клеточных рецепторов и ионных каналов, вызывая разрушение клеток любого органа, в том числе и печени. В этих условиях звездчатые клетки печени приобретают свойства миофибробластов, в которых увеличивается синтез коллагена, снижаются активность и скорость секреции металлопротеиназ. Активация трансформации этих клеток также может быть вызвана различными фиброгенными противовоспалительными цитокинами (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6), фактором роста фибробластов, трансформирующим фактором роста, оксидом азота, которые образуются в клетках Купфера на фоне окислительного стресса. Помимо этого, накопление коллагена и последующее за этим фиброзирование печени можно связать с усилением процесса неферментативного гликирования коллагена, вызванного хронической гипергликемией, что приводит к повышению его устойчивости к действию металлопротеиназ.
При введении даларгина животным с аллоксановым диабетом авторы наблюдали достоверное снижение уровня глюкозы в крови в сравнении с группой животных «Аллоксановый диабет» к 10-му дню на 56,5% (р<0,01), к 30-му дню на 67,5% (р<0,001), а также уменьшение количества гликозилированного гемоглобина на 55,5% (р<0,001) и 53% (р<0,001) соответственно. Известно, что даларгин, являясь представителем класса опиодных пептидов, может регулировать количество в клетках цАМФ и уровень кортизола, катехоламинов, стимулирующих процессы перекисного окисления липидов [13]. Вероятно, в результате ограничения свободно-радикальных процессов даларгин оказывает мембраностабилизирующее действие, что может частично предотвращать повреждение поджелудочной железы, вызванное аллоксаном.
В гомогенатах печени крыс к концу опыта на фоне роста уровня свободного гидроксипролина и нейтральносолерастворимой фракции коллагена на 25,9% (р<0,01) и 300% (р<0,001) соответственно отмечалось снижение содержания суммарного коллагена на 41,7% (р<0,001) по сравнению с группой крыс с аллоксановым диабетом без введения даларгина. Полученные данные свидетельствуют об активации метаболического оборота коллагена, но при этом наблюдается менее активное накопление данного белка в печени. Полученные результаты можно объяснить с нескольких позиций. Доказано, что даларгин реализует свой эффект через опиоидные рецепторы (относятся к семейству G-белок-сопряженных рецепторов, регулирующих активность ферментов синтеза внутриклеточных мессенджеров), которые расположены на наружной поверхности цитоплазматической мембраны многих клеток. Используя этот механизм, даларгин оказывает влияние на прооксидантные и антиоксидантные внутриклеточные факторы [14]. Имеются данные, что даларгин способен регулировать активность NО-синтазы в клетках Купфера и продукцию оксида азота, обладающего прооксидантными свойствами, в результате чего снижается скорость трансформации звездчатых клеток, активно синтезирующих коллаген. Кроме того, ряд исследователей обнаружили способность даларгина снижать количество некоторых цитокинов, таких как интерлейкин-1 и интерлейкин-6 [15]. Одним из эффектов интерлейкина-6 является его способность стимулировать синтез гепатоцитами С-реактивного протеина и триглицеридов. Учитывая, что при сахарном диабете накопление триглицеридов гепатоцитами и снижение скорости выведения из них липопротеинов являются провоцирующими факторами развития стеатогепатоза и дальнейшего фиброза, можно предположить, что даларгин положительно влияет и на это патогенетическое звено, препятствуя избыточному накоплению коллагена.
Заключение. Полученные авторами в ходе исследования результаты свидетельствуют об интенсификации процессов накопления коллагена в печени при аллоксановом диабете, что способствует фиброзированию данного органа. Это может быть связано с усилением процесса гликозилирования коллагена и повышением его устойчивости к действию протеаз, а также трансформацией звездчатых клеток печени в миофибробласты под действием провоспалительных факторов. При введении даларгина на фоне аллоксанового диабета отмечалось менее активное накопление коллагена, обусловленное, вероятно, нормализацией баланса прооксидантных и антиоксидантных систем, что предупреждает развитие цитолитического синдрома и может способствовать восстановлению функциональной активности печени.