Гематоофтальмический барьер – это защитный механизм организма, который помогает поддерживать гомеостаз при воздействии на организм факторов, способных нарушить его равновесие [1]. В основе этого механизма лежит барьер между кровью и влагой глаза, предотвращающий их взаимное влияние. Его основная функция заключается в регулировании поступления и выведения различных веществ, связанных с нормальным и патологическим обменом веществ [2]. Кроме того, эндотелиальные клетки микроциркуляторного русла глаза играют важную роль в защите от проникновения микроорганизмов, антител и лейкоцитов в жидкие среды глаза [3]. В связи с уникальными физиологическими особенностями глаза и его особой защитой со стороны иммунной системы возникает сложная проблема терапии проникающих травм глаза и их лечения, которая требует использования мультидисциплинарного подхода [4]. Механическая травма глаза является примером ограниченного повреждения, при котором не только изменяются местные реакции с нарушением механизмов иммунoсупрессии непосредственно в органе, но и происходят системные изменения в иммунной системе в целом [5]. Травма глаза сопровождается местным и системным воспалением и, как следствие, оксидативным стрессом [6]. Организм всегда подвержен окислительным процессам, которые вызваны свободными радикалами и необходимы для обмена веществ, дыхания и иммунных реакций. Однако сбалансированный процесс восстановления обеспечивается наличием как внутренних, так и внешних антиоксидантов [7]. В случае воспаления количество свободных радикалов увеличивается, а окислительные процессы превышают возможности восстановления. Это приводит к усиленному разрушению не только поврежденных клеток, но и здоровых, нарушая нормальное функционирование всего организма [8].
Таким образом, цель исследования состояла в изучении морфологических изменений рубца и поврежденных тканей глаза при экспериментальной механической травме и использовании природного антиоксиданта в качестве компонента экспериментальной терапии.
Материалы и методы исследования. Эксперимент был проведен на 120 беспородных крысах мужского пола восьмимесячного возраста массой 240–260 г. Всем животным наносили проникающее ранение обоих глаз в специальном приспособлении-фиксаторе с помощью микролезвия длиной 4 мм под местной анестезией (2%-ный раствор новокаина) в области лимба. При этом происходило одновременное ранение роговицы, склеры и сосудистого тракта. Животным 1-й группы не проводили терапию механической травмы глаза. Крысы 2-й группы получали стандартную терапию травмы глаза, животные 3-й группы – стандартную терапию с добавлением инъекций кверцетина внутрибрюшинно и 4-й группы – только инъекции кверцетина. Подробная методика проведения эксперимента представлена авторами в ранее опубликованной работе [9]. Для оценки активности деления клеток в многослойном плоском эпителии (МПЭ) роговицы исследовали глаза интактных и экспериментальных животных.
Препараты глаз фиксировали в растворе 10%-ного нейтрального формалина, а затем дегидратировали с помощью спирта, потом материал помещали в парафиновые блоки и готовили срезы, исследование которых проводилось с помощью окулярной стереометрической сетки Г.Г. Автандилова. Учитывали количество (плотность) коллагеновых и эластических волокон, фибробластов, макрофагов, лимфоцитов, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитов, плазматических клеток в окружающих рубец тканях и митотическую активность МПЭ роговицы глаза.
Полученный цифровой материал подвергался статистической обработке путем непараметрического статистического анализа с использованием критерия Манна–Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение. Таблицы 1 и 2 содержат информацию о количественных характеристиках структурных элементов рубца и поврежденных тканей глаза.
Таблица 1
Количественные характеристики структурных элементов рубца поврежденного глаза на 7-е и 14-е сутки после травмы при разных способах терапии (в 0,01 мм2)
|
Сутки после травмы |
Группа |
Коллагеновые и эластические волокна |
Фибробласты |
|
7-е |
1 |
58,39±1,88 |
9,62±0,31 |
|
2 |
58,17±2,27 |
16,21±0,571 |
|
|
3 |
44,76±1,621 |
11,62±0,411 |
|
|
4 |
57,61±2,13 |
15,37±0,541 |
|
|
14-е |
1 |
61,92±2,17 |
10,39±0,392 |
|
2 |
60,74±2,06 |
19,93±0,752,3 |
|
|
3 |
49,22±1,932,3 |
15,41±0,582,3 |
|
|
4 |
51,81±2,362,3 |
15,04±0,752,3 |
Примечание. В этой таблице различия достоверны при p<0,05: 1 – по сравнению с показателями 1-й группы на 7-е сутки опыта; 2 – по сравнению с показателями этой же группы на 7-е сутки опыта; 3 – по сравнению с показателем 1-й группы на 14-е сутки опыта.
На 7-е сутки эксперимента количество коллагеновых и эластических волокон в зоне рубца поврежденного глаза у животных 2-й и 4-й групп практически не отличалось от аналогичных показателей крыс 1-й группы без терапии механической травмы глаза. При этом у животных 3-й группы отмечено снижение количества коллагеновых и эластических волокон в зоне рубца поврежденного глаза на 23,3% по сравнению с крысами 1-й группы. На 14-е сутки установлены увеличение количества коллагеновых и эластических волокон в зоне рубца у животных 1-й, 2-й и 3-й групп на 6,0%, 4,4%, и на 9,9% соответственно и снижение у животных 4-й группы на 10,1% по сравнению с 7-ми сутками опыта. Стоит отметить, что у животных 3-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта количество коллагеновых и эластических волокон в рубце достоверно отличалось от аналогичных показателей животных 1-й группы в меньшую сторону на 16,3% и 20,5% соответственно.
Количество фибробластов в зоне рубца поврежденного глаза у животных 2-й, 3-й и 4-й групп было достоверно большое, чем в 1-й группе, на 68,5%, 20,8% и 59,8% соответственно. На 14-е сутки также установлено увеличение количества фибробластов в зоне рубца у животных в 1-й, 2-й и 3-й группах на 8,0%, 22,9% и 32,6% соответственно, а у животных 4-й группы количество фибробластов в зоне рубца незначительно снизилось по сравнению с 7-ми сутками опыта. Стоит отметить, что у животных 2-й, 3-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта количество фибробластов в рубце достоверно отличалось от аналогичного показателя животных 1-й группы в большую сторону на 91,8%, 48,3% и 44,7% соответственно.
Таблица 2
Количество гранулоцитов, макрофагов, лимфоцитов и плазматических клеток в прилежащих к рубцу тканях глаза при разных способах терапии (в 0,01 мм2)
|
Группа |
Сутки после травмы |
Гранулоциты |
Макрофаги |
Лимфоциты |
Плазматические клетки |
|
1-я |
7 |
0,86±0,03 |
0,92±0,03 |
0,43±0,02 |
0,13±0,01 |
|
14 |
2,71±0,102 |
0,79±0,022 |
1,68±0,062 |
0,36±0,022 |
|
|
2-я |
7 |
1,24±0,041 |
1,97±0,071 |
2,86±0,101 |
0,21±0,011 |
|
14 |
1,62±0,062,3 |
1,82±0,063 |
3,26±0,122,3 |
0,33±0,012,3 |
|
|
3-я |
7 |
2,21±0,081 |
1,09±0,041 |
2,17±0,091 |
0,29±0,011 |
|
14 |
1,45±0,052,3 |
1,37±0,052,3 |
2,03±0,083 |
1,82±0,062,3 |
|
|
4-я |
7 |
0,99±0,031 |
1,74±0,061 |
1,93±0,071 |
0,17±0,011 |
|
14 |
2,32±0,082,3 |
1,31±0,042,3 |
2,47±0,092,3 |
0,33±0,012,3 |
Примечание. В этой таблице различия достоверны при p<0,05: 1 – по сравнению с показателями 1-й группы на 7-е сутки опыта; 2 – по сравнению с показателями этой же группы на 7-е сутки опыта; 3 – по сравнению с показателем 1-я группы на 14-е сутки опыта.
На 7-е сутки эксперимента количество гранулоцитов в зоне рубца поврежденного глаза у животных 2-й, 3-й и 4-й групп было больше, чем у крыс 1-й группы без терапии механической травмы глаза, на 44,1%, 157,0% и 15,1% соответственно. К 14-м суткам опыта в зоне рубца поврежденного глаза у животных 1-й, 2-й и 3-й групп количество гранулоцитов продолжало расти на 215,1%, 30,6% и 134,3% соответственно, а у животных 3-й группы снизилось на 34,3%. Установлено, что у животных 2-й, 3-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта количество гранулоцитов в рубце достоверно отличалось от показателей животных 1-й группы в меньшую сторону на 40,2%, 46,5% и 14,4% соответственно.
На 7-е сутки эксперимента количество макрофагов в зоне рубца поврежденного глаза у животных 2-й, 3-й и 4-й групп было больше, чем у крыс 1-й группы без терапии механической травмы глаза, на 116,3%, 18,5% и 89,1% соответственно. На 14-е сутки опыта у животных 1-й, 2-й и 4-й групп зафиксировано снижение количества макрофагов в зоне рубца поврежденного глаза на 14,1%, 7,6% и 24,7% соответственно от значения на 7-е сутки, а у животных 3-й группы наблюдалась обратная тенденция – возрастание количества макрофагов в зоне рубца поврежденного глаза на 25,7%. В целом у животных 2-й, 3-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта количество макрофагов в зоне рубца поврежденного глаза достоверно было больше, чем у животных 1-й группы, на 130,4%, 73,4% и 65,8% соответственно.
На 7-е сутки эксперимента количество лимфоцитов в зоне рубца поврежденного глаза у животных 2-й, 3-й и 4-й групп было больше, чем у крыс 1-й группы без терапии механической травмы глаза, в 6,7 раза, 5,0 раза и 4,5 раза соответственно. На 14-е сутки опыта у животных 1-й, 2-й и 4-й групп зафиксировано возрастание количества лимфоцитов в зоне рубца поврежденного глаза на 290,7%, 14,0% и 27,9% соответственно от значения на 7-е сутки, а у животных 3-й группы наблюдалась обратная тенденция – снижение количества лимфоцитов на 6,5%. У животных 2-й, 3-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта количество лимфоцитов в зоне рубца поврежденного глаза достоверно было больше, чем у животных 1-й группы, на 94,0%, 20,8% и 47,0% соответственно.
На 7-е сутки эксперимента количество плазматических клеток в зоне рубца поврежденного глаза у животных 2-й, 3-й и 4-й групп было больше, чем у крыс 1-й группы без терапии механической травмы глаза, на 61,5%, 123,1% и 30,8% соответственно. На 14-е сутки опыта у животных 1-й, 2-й, 3-й и 4-й групп зафиксировано возрастание количества плазматических клеток в зоне рубца поврежденного глаза на 176,9%, 57,1%, 531,7% и 94,1% соответственно от значения на 7-е сутки. У животных 2-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта количество плазматических клеток в зоне рубца поврежденного глаза достоверно было меньше, чем у животных 1-й группы, на 8,3%, а у животных 3-й группы – больше на 405,6%. Митотическая активность многослойного плоского эпителия роговицы в зоне повреждения у животных различных групп представлена в таблице 3.
Таблица 3
Митотическая активность многослойного плоского эпителия роговицы в зоне повреждения при разных способах терапии (0/00)
|
Группа |
Сутки после травмы |
Митотический индекс, (0/00) |
|
1-я |
7-е |
6,21±0,19 |
|
14-е |
12,36±0,472 |
|
|
2-я |
7-е |
10,48±0,371 |
|
14-е |
8,79±0,312,3 |
|
|
3-я |
7-е |
14,62±0,411 |
|
14-е |
21,05±0,272,3 |
|
|
4-я |
7-е |
9,57±0,23 |
|
14-е |
10,09±0,363 |
Примечание. В этой таблице различия достоверны при p<0,05: 1 – по сравнению с показателями 1-й группы на 7-е сутки опыта; 2 – по сравнению с показателями этой же группы на 7-е сутки опыта; 3 – по сравнению с показателем 1-й группы на 14-е сутки опыта.
На 7-е сутки эксперимента митотический индекс многослойного плоского эпителия роговицы в зоне повреждения у животных 2-й, 3-й и 4-й групп был больше, чем у крыс 1-й группы без терапии механической травмы глаза, на 68,8%, 135,4% и 5,8% соответственно. На 14-е сутки опыта у животных 1-й, 3-й и 4-й групп зафиксировано возрастание митотического индекса многослойного плоского эпителия роговицы в зоне повреждения на 99,0%, 44,0% и 5,4% соответственно от значения на 7-е сутки, а в группе 2 установлено снижение митотического индекса на 16,1%. У животных 2-й и 4-й групп на 14-е сутки опыта митотический индекс многослойного плоского эпителия роговицы в зоне повреждения достоверно был меньше, чем у животных 1-й группы, на 28,9%, и 18,4% соответственно, а у животных 3-й группы – больше на 70,3%.
Данные световой микроскопии зоны повреждения глаза крыс на 7-е сутки после механической травмы глаза представлены на рисунке 1.
|
а – морфологическая картина глаза крыс 1 группы (без терапии), х200 |
б – морфологическая картина глаза крыс 2 группы (стандартная терапии), х150 |
|
в- морфологическая картина глаза крыс 3-й группы (стандартная терапии + кверцетин), х150 |
г- морфологическая картина глаза крыс 4-й группы (терапия кверцетином), х70 |
Рис. 1. Световая микроскопия зоны повреждения глаза экспериментальных животных
Морфологическая картина глаз крыс 1-й группы без терапии характеризуется следующими особенностями: формируется грубый васкуляризированный рубец на поврежденной области роговицы и склеры, при этом отсутствует эпителизация и имеются выраженные признаки экссудативного воспаления и инфильтрации полиморфонуклеарными лейкоцитами. У животных 2-й и 3-й групп, которым проводили терапию, наблюдалась полная эпителизация зоны повреждения малодифференцированным эпителием. Волокнистая соединительная ткань с продольной ориентацией коллагеновых волокон начинает формироваться. В инфильтрате можно наблюдать лимфоциты и плазмоциты, но их количество невелико. Добавление инъекций кверцетина к стандартной терапии приводит к оптимизации течения воспаления после травмы глаза. В зоне повреждения наблюдается ускорение регенерации тканей. У животных 4-й группы, которым проводили терапию только кверцетином, наблюдалась полная эпителизация зоны повреждения малодифференцированным эпителием. Волокнистая соединительная ткань имеет очаговую продольную ориентацию коллагеновых волокон. В слабо выраженном воспалительном инфильтрате преобладают лимфоциты. Таким образом, использование кверцетина вместе со стандартной терапией позволяет ускорить процесс регенерации тканей и улучшить морфологическую картину глаза после травмы.
При механической травме глаза и нарушении целостности гематоофтальмического барьера развиваются нейроэндокринные изменения, которые могут иметь различные последствия. В частности, повышенная выработка кортикотропин-рилизинг гормона и глюкокортикоидов может привести к снижению иммунной ответственности организма, что может способствовать развитию инфекций и замедлению процесса регенерации тканей. Также изменение экспрессии β-адренорецепторов может затруднить функционирование нервной системы и вызвать различные нейрологические симптомы.
Переключение цитокинового профиля с Тh1 на Th2 тип также может иметь важные последствия. В условиях увеличенной концентрации глюкокортикоидов и катехоламинов Th2-иммунный ответ активируется, что может привести к аллергическим и автоиммунным реакциям или усилению уже существующих. Нарушение баланса между Th1 и Th2 ответами также может быть связано с развитием хронических воспалительных процессов.
Таким образом, дисфункция иммунной системы, вызванная травмой глаза и нарушением целостности гематоофтальмического барьера, может иметь широкий спектр последствий, связанных с нейроэндокринными изменениями и изменением цитокинового профиля. Это подчеркивает важность своевременной и комплексной терапии при таких повреждениях с целью предотвращения негативных последствий и обеспечения нормального восстановления организма.
В результате проведенных исследований установлены особенности морфологического строения структур роговицы в динамике восстановительного процесса при механической травме глаза у животных на 7-е и 14-е сутки при разных способах терапии. Стандартная терапия травмы глаза и стандартная терапия с добавлением инъекций кверцетина в разной степени повышают пролиферативную активность фибробластов и синтез коллагеновых и эластических волокон в зоне рубца роговицы. Напротив, терапия только кверцетином стимулирует синтетическую активность фибробластов в рубце роговицы с образованием компонентов межклеточного матрикса, снижая продукцию коллагеновых волокон, в динамике модулирует воспалительную реакцию в рубце и околорубцовых тканях, повышая численность иммунокомпетентных клеток. У животных с механической травмой глаза в условиях применения кверцетина в дополнение к стандартной терапии и в отличие от нее в ранние и поздние сроки после травмы активируется морфофункциональное состояние эпителия роговицы в зоне рубца за счет повышения митотической активности его клеток, свидетельствующее об интенсивных репаративных процессах в роговице, отмечается увеличение числа иммунокомпетентных клеток в околорубцовых зонах. При этом при введении кверцетина в варианте монотерапии также наблюдается уменьшение интенсивности гнойного воспаления и фагоцитоза в отдаленном периоде после механической травмы глаза.
Наиболее интенсивно воспаление на фоне механической травмы глаза проявляется у крыс 1-й группы без лечения в виде повышения количества лимфоцитов и полинуклеарных лейкоцитов в инфильтрате, а также интенсивным отеком роговицы в области рубца и грубым характером его организации. Комплексная терапия механической травмы глаза с добавлением инъекций кверцетина привела к снижению лимфоплазмоцитарной инфильтрации зоны травмы, снижению количества полиморфноядерных лейкоцитов в инфильтрате, а также снижению отека роговицы в зоне рубца и его зрелому формированию. Терапия только кверцетином и стандартная терапия травмы глаза морфологически проявлялись небольшой лимфоплазмоцитарной инфильтрацией с небольшим количеством мигрирующих клеток, что затрудняло регенерационные процессы. Положительные эффекты кверцетина в составе комплексной терапии травмы глаза, вероятно, связаны с его опосредованным эффектом интенсификации синтеза цитокинов и модуляции выработки TNF-α лимфоцитами и другими клетками моноцитарно-макрофагальной системы.
Выводы
дополнение стандартной терапии травмы глаза инъекциями кверцетина способствует интенсификации репаративных процессов, уменьшению интенсивности гнойного воспаления и фагоцитоза в отдаленном периоде, увеличению числа иммунокомпетентных клеток в околорубцовых зонах.