Ранее нами было установлено, что при хроническом введении нейролептических средств у экспериментальных животных в сыворотке крови обнаруживается повышенный уровень аутоантител (ААТ) к дофаминовым и к NMDA рецепторам [1]. При длительном введении агонистов дофаминовых рецепторов также наблюдается повышение содержания ААТ к этим же рецепторам [2]. Интересно, что были установлены корреляционные связи между уровнями ААТ и выраженностью каталептогенного действия галоперидола [3]. Эти данные позволили предположить, что ААТ к нейрорецепторам, с которыми взаимодействуют нейро- и психотропные препараты, вероятно, принимают участие в реализации их специфической активности [3].
Способность циркулирующих в крови ААТ проникать через ГЭБ и оказывать воздействие на рецепторы мозга обсуждается. Предполагается возможность интратекального образования антител [4, 5]. Сравнительно недавно появилось несколько методически качественно выполненных работ, в которых приводятся данные, подтверждающие, что антитела IgG способны диффундировать в ткань мозга у животных без повреждения гематоэнцефалического барьера [6, 7]. В связи с этим представлялось интересным решить две задачи: выяснить способность ААТ к нейрорецепторам проникать в ткани головного мозга у животных, а также изучить динамику уровней ААТ в сыворотке крови и в тканях головного мозга в различные сроки хронического введения галоперидола – классического антипсихотического средства.
Цель исследования – изучить изменение уровней ААТ к нейрорецепторам в сыворотке крови и ткани переднего мозга у крыс при хроническом введении галоперидола.
Материалы и методы исследования
Опыты были выполнены на 36 белых лабораторных крысах самцах линии Wistar с массой тела 250–280 г, которые содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.
Были сформированы 7 групп животных. Крысам контрольной группы (первая группа – 6 крыс) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Остальные животные получали внутрибрюшинно галоперидол в дозе 0,1 мг/кг: вторая группа (5 крыс) в течение 2 недель ежедневно, третья (5 крыс), четвертая (5 крыс), пятая (5 крыс), шестая (5 крыс) и седьмая (5 крыс) группы в течение 4 недель ежедневно.
После завершения инъекций у крыс забирали кровь по следующей схеме: первая группа (контрольная) – через 3 дня после последней инъекции физиологического раствора; вторая группа – на следующие сутки после завершения введения галоперидола в течение 2 недель; третья группа – на следующие сутки после завершения введения галоперидола в течение 4 недель; четвертая группа – через 3 суток после последней инъекции в течение 4 недель; пятая группа – через 7 суток; шестая группа – через 14 суток, седьмая – через 4 недели после последней инъекции галоперидола.
Кровь забирали в пробирки, отстаивали в течение 30 минут при температуре +37оС, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. Полученные образцы сыворотки хранились в морозильной камере при температуре –40оС. Крыс декапитировали и извлекали головной мозг, который отмывали от крови холодным физиологическим раствором в течение 40–50 сек, очищали от паутинной оболочки, обсушивали на фильтровальной бумаге и замораживали. Материал до проведения иммунологического тестирования хранился в морозильной камере при температуре –40оС. Перед исследованием на наличие ААТ передний мозг взвешивали, измельчали и гомогенизировали механически, добавляли охлажденный фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,4) в соотношении «ткань : буфер – 1:3), перемешивали, осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочная жидкость использовалась для проведения иммуноферментного анализа (ИФА).
Количественное определение уровней ААТ в сыворотке крови и супернатанте гомогената головного мозга проводили с помощью ИФА. Оценивали концентрацию ААТ (IgG) в сыворотке крови и мозговой ткани к дофаминовым рецепторам 1-го и 2-го типов (DR1 и DR2), а также к NR1, NR2A, NR2B субъединицам NMDA рецептора. Содержание ААТ к белку S100B оценивали в сыворотке крови. Кроме того, определяли уровень специфических антител (АТ) IgG к галоперидолу. На твердой фазе полистироловых планшетов был иммобилизован антиген соответствующего рецептора или белка S100B (Cloud-Clone Corp. – США/КНР) либо галоперидола. Применялись тест-системы, разработанные ООО НПО «Иммунотэкс» (Россия). Исследование проводили на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Лазурит» (Dynex Technologies, США) при длине волны 450 нм.
Статистический анализ полученных результатов измерений выполняли с применением прикладных программ STATISTICA (StatSoft Inc., США). Учитывая, что по данным критерия Шапиро–Уилка распределения не соответствовали нормальному, применяли методы непараметрической статистики.
Исследование выполнялось в соответствии с положениями Женевской конвенции 1985 года о международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных и Хельсинкской декларацией 2000 года о гуманном отношении к животным, а также приказа МЗ РФ № 199н «Об утверждении правил лабораторной практики» от 1 апреля 2016 г.
Результаты исследования и их обсуждение
У крыс контрольной группы содержание ААТ в сыворотке крови колебалось (min-max) в пределах 0,8–10,9 Ед/мл, а в ткани мозга – 0,4–1,8 Ед/мл. Длительное ежедневное введение галоперидола вызывало выраженное нарастание уровня ААТ к нейрорецепторам и в сыворотке крови (табл. 1), и в ткани головного мозга. При этом уровни ААТ в ткани мозга были значительно ниже (табл. 2), чем в сыворотке, но достоверно выше, чем в мозге у контрольной группы крыс (р<0,01).
Анализ изменений ААТ в сыворотке крови показывает, что их уровень нарастал к концу инъекционной процедуры (4 недели введения), и начинал снижаться через 7 суток, и особенно через 14 суток после последней инъекции нейролептика. Следует обратить внимание на то, что уровень ААТ к дофаминовым рецепторам начинал снижаться уже через 3 суток после последнего введения препарата. При этом содержание ААТ к NMDA рецепторам (NR1 и NR2A) в эти сроки еще оставалось высоким. Через 4 недели после прекращения введения галоперидола уровень ААТ в сыворотке крови заметно снижался и был сопоставим со значениями в контрольной группе животных.
Изменение содержания в сыворотке крови ААТ к белку S100B происходило аналогичным образом: было наибольшим в конце курса инъекций (сразу по завершении введения галоперидола в течение 4 недель), а также через 3 суток после окончания иммунизации. Затем происходило постепенное снижение уровня ААТ (табл. 1).
Таблица 1
Изменение уровней аутоантител (Ед/мл) к нейрорецепторам и белку S100B в сыворотке крови у крыс [Me (Q1-3)]
|
ААТ к мозговым антигенам |
2 недели введения |
4 недели введения |
Через 3 суток после последней инъекции |
Через 7 суток после последней инъекции |
Через 14 суток после последней инъекции |
|
DR1 |
122,6 (95,3–177,8) |
205,7 (157,8–212,9) |
188,4 (109,9–208,1) |
118,0 (116,9–134,3) |
70,7 (63,8–82,8) |
|
DR2 |
83,7 (68,1–119,8) |
141,4 (117,0–169,3) |
104,6 (94,8–110,9) |
98,8 (89,5–106,1) |
39,9 (35,8–40,3) |
|
NR1 |
87,5 (75,1–171,6) |
160,4 (120,6–233,4) |
161,8 (155,3–171,3) |
75,9 (75,3–162,5) |
48,2 (34,0–62,3) |
|
NR2A |
135,7 (98,7–179,1) |
296,6 (272,9–307,7) |
270,0 (265,7–298,1) |
201,9 (191,8–209,9) |
92,0 (82,6–98,2) |
|
NR2B |
71,7 (69,3–72,4) |
102,6 (100,8–104,6) |
90,7 (80,8–92,7) |
69,5 (68,1–74,5) |
41,2 (38,3–43,8) |
|
Белок S100B |
83,2 (65,5–100,0) |
107,8 (101,4–173,6) |
110,5 (90,6–114,0) |
76,0 (56,9–85,5) |
33,4 (29,7–37,6) |
В ткани переднего мозга крыс, длительно получавших галоперидол, также обнаруживались высокие по сравнению с контрольной группой крыс уровни ААТ и к дофаминовым, и к NMDA рецепторам. Максимальное накопление ААТ в мозговой ткани прослеживалось через 4 недели регулярного введения нейролептика, а также через 3 суток после последнего введения препарата. Интересно, что содержание ААТ к NR1 продолжало увеличиваться к этому сроку, хотя уровни ААТ к другим рецепторам практически не менялись с момента прекращения инъекций. При оценке концентрации ААТ в переднем мозге крыс через 7 суток после последнего введения галоперидола обнаружено, что их содержание заметно снижалось. Через 14 суток в ткани мозга уровни ААТ были уже близки к контрольным значениям. Впрочем, в эти сроки количество ААТ было достоверно выше, чем у контрольных крыс к NR2В (р=0,006), к DR1 (р=0,045) и к DR2 (р=0,018). Через 4 недели после завершения инъекций различий между опытными и контрольными крысами по содержанию ААТ в ткани мозга не выявлялось.
Таблица 2
Изменение уровней аутоантител (Ед/мл) к нейрорецепторам в ткани головного мозга крыс [Me (Q1-3)]
|
ААТ мозговым антигенам |
2 недели введения |
4 недели введения |
Через 3 суток после последней инъекции |
Через 7 суток после последней инъекции |
Через 14 суток после последней инъекции |
|
DR1 |
16,5 (12,5–24,8) |
34,0 (21,8–35,1) |
33,8 (28,8–35,4) |
18,1 (15,8–31,4) |
1,5 (1,4–1,6) |
|
DR2 |
10,9 (7,6–15,7) |
22,6 (15,8–24,6) |
21,2 (14,7–23,0) |
8,4 (7,1–9,3) |
1,77 (1,5–1,84) |
|
NR1 |
11,9 (10,2–25,5) |
16,4 (10,3–42,9) |
21,7 (18,1–25,7) |
10,2 (9,8–10,3) |
1,9 (1,3–2,0) |
|
NR2A |
12,5 (11,8–14,5) |
23,5 (18,1–25,1) |
22,9 (17,4–24,5) |
14,5 (13,2–21,5) |
2,1 (1,5–2,2) |
|
NR2B |
8,4 (6,9–13,7) |
13,9 (12,8–14,3) |
11,9 (10,4–15,4) |
11,1 (8,9–11,3) |
1,6 (1,5–1,8) |
Сравнение уровней ААТ в сыворотке и в ткани головного мозга (табл. 1 и табл. 2) показывает, что наиболее высокими в крови были уровни ААТ к DR1 и к NR2A. В ткани головного мозга также наиболее высокими были уровни ААТ к DR1 и к NR2A. Напротив, уровни ААТ к DR2 и NR2B были меньшими в крови и в головном мозге. Следовательно, просматривается определенный параллелизм в содержании ААТ в крови и ткани переднего мозга у крыс.
В связи с этим представлялось интересным провести корреляционный анализ (по Спирмену) для выявления связи содержания ААТ в сыворотке крови и ткани мозга. Действительно, оказалось, что содержание ААТ к конкретным нейрорецепторам в обоих изученных объектах было сильно связано. Коэффициенты корреляции соответственно составляли для NR1 r=0,8; NR2A r=0,74; NR2B r=0,8; DR1 r=0,84; DR2 r=0,82. Следовательно, высокое содержание ААТ в сыворотке крови совпадает с высоким уровнем этих же ААТ в ткани мозга. Эти данные хорошо согласуются с наблюдениями некоторых авторов, которые показали, что антитела IgG способны проникать через ГЭБ либо синтезироваться иммунной системой мозга [4, 5, 6].
Сывороточный уровень ААТ к белку S100B был сильно связан с содержанием ААТ к NR2B (r=0,849; p<0,05), DR1 (r=0,74; p<0,05), DR2 (r=0,72; p<0,05). Связь расценивалась как заметная с уровнями ААТ к NR1 (r=0,58; p<0,05) и NR2A (r=0,69; p<0,05). Следует отметить, что сывороточный уровень ААТ к белку S100B был сильно связан с содержанием в ткани мозга ААТ к NR1 (r=0,70; p<0,05), NR2A (r=0,82; p<0,05), NR2B (r=0,80; p<0,05). Отмечалась также сильная связь с ААТ в мозге к DR1 (r=0,74; p<0,05) и заметная с ААТ к DR2 (r=0,61; p<0,05).
В ходе исследования было обнаружено, что в сыворотке крови и ткани переднего мозга определялись специфические IgG к нейролептику – галоперидолу (табл. 3). У контрольных животных эти АТ не были обнаружены. Можно видеть, что соотношение количества АТ к галоперидолу в крови и мозге было аналогичным для ААТ к нейрорецепторам.
Таблица 3
Изменение содержания антител (IgG) к галоперидолу (Ед/мл) в сыворотке крови и в ткани мозга [Me (Q1-3)]
|
АТ к галоперидолу |
2 недели введения |
4 недели введения |
Через 3 суток после последней инъекции |
Через 7 суток после последней инъекции |
Через 14 суток после последней инъекции |
|
В сыворотке крови |
102,9 (90,6–125,2) |
111,7 (101,1–181,1) |
96,3 (84,4–107,2) |
74,2 (71,3–87,5) |
10,8 (10,3–11,7) |
|
В ткани мозга |
13,8 (12,1–16,1) |
11,4 (11,1–11,8) |
11,2 (9,5–12,8) |
9,7 (9,3–10,0) |
8,1 (7,0–8,5) |
После прекращения инъекций препарата содержание АТ к галоперидолу снижалось. При этом в ткани мозга уровень АТ уменьшался медленнее. Через 14 суток после последней инъекции галоперидола содержание АТ к нему в сыворотке крови и в ткани мозга было сопоставимо. При корреляционном анализе установлено наличие заметной связи уровней АТ в крови и ткани мозга (r=0,56; p<0,05). Следует отметить, что связи между уровнями ААТ к нейрорецепторам в крови и мозге были заметно сильнее.
Таким образом, выполненное исследование подтвердило ранее полученные данные о способности галоперидола повышать уровень ААТ (IgG) к дофаминовым (DR1 DR2) и к NMDA рецепторам [1]. При этом было установлено, что содержание ААТ в сыворотке крови у иммунизированных животных остается высоким (по сравнению с контролем) через 7 и 14 суток после последней инъекции галоперидола. Важно, что хроническое применение галоперидола вызывало повышение количества ААТ и в ткани головного мозга животных. При этом достаточно высокое содержание ААТ сохранялось в течение 7 суток после последней инъекции препарата. Обнаруженная способность ААТ (IgG) накапливаться в ткани мозга совпадает с наблюдениями других авторов [6]. Это позволяет предположить, что ААТ к нейрорецепторам могут оказывать специфическое воздействие на функцию конкретных рецепторов. Возможно, что после отмены препаратов ААТ какое-то время тоже оказывают свое действие.
Считают, что белок S100B, как и ААТ к нему, является важным маркером эксайтотоксичности [8, 9, 10]. В связи с этим можно предположить, что накопление ААТ к NMDA рецепторам в ткани головного мозга запускает процесс эксайтотоксичности с последующим освобождением белка S100B и накоплением ААТ к нему в сыворотке крови.
Заключение
Таким образом, длительное введение галоперидола крысам вызывает нарастание уровней ААТ к NMDA и дофаминовым рецепторам в сыворотке крови и в ткани головного мозга. При этом уровни ААТ в крови и ткани мозга были тесно связаны. После прекращения введения препарата содержание ААТ в сыворотке крови снижалось, но оставалось через 14 дней после последней инъекции заметно выше, чем у контрольных животных. В ткани мозга содержание ААТ также параллельно снижалось после прекращения введений галоперидола. Следовательно, в ответ на введение галоперидола развивается аутоиммунный ответ с накоплением аутоантител к NMDA и дофаминовым рецепторам не только в крови, но и в ткани головного мозга, что, вероятно, может модифицировать психотропные эффекты и реализовывать побочное действие нейролептика.