Данные эпидемиологических исследований показывают, что бронхиальная астма (БА) – это одно из наиболее распространенных заболеваний респираторного тракта [1]. Продолжает отмечаться рост заболеваемости БА, в том числе и среди детей. Также увеличивается доля этого заболевания в структуре инвалидности и смертности, повышая размеры экономического ущерба [2]. Выраженная медико-социальная значимость БА требует глубокого изучения патогенеза и поиска эффективных методов ранней диагностики, профилактики и лечения [3].
Показано, что одним из ключевых механизмов патогенеза БА является оксидативный и/или нитрозивный стресс, связанный, в частности, с усилением продукции активных форм кислорода и азота (АФК и АФА соответственно) [4].
В настоящее время активно изучается роль оксида азота (NO) в механизмах развития БА. На сегодняшний день NO и целый ряд его метаболитов (нитрит- и нитрат-анионы (NO2- и NO3- соответственно), S-нитрозотиолы, динирозильные комплексы железа (ДНКЖ), 3-нитротирозин и пр.) находят применение в диагностике и мониторинге течения БА [5].
Совокупность метаболических путей NO объединена в понятие «цикл оксида азота». Под циклом оксида азота подразумеваются NOS-зависимый и NOS-независимый пути синтеза NO, а также весь каскад окислительно-восстановительных реакций [6]. Многие этапы цикла NO являются кислородзависимыми. Известно, что процесс синтеза NO является комплексной окислительной реакцией, которую катализирует фермент NO-синтаза (NOS), присоединяющий молекулу кислорода к конечному атому азота гуанидиновой группы L-аргинина. Изучение влияния концентрации кислорода, в частности гипоксии, на цикл NO актуально еще и в свете имеющихся данных, в которых показано, что в условиях гипоксии NO может продуцироваться в NOS-независимых механизмах нитрит- и нитратредуктазноподобными ферментами (неоптерин и пр.) [7].
В настоящее время пониженная концентрация кислорода, а именно нормобарическая интервальная гипокситерапия (ИГТ), используется в качестве эффективного нелекарственного метода лечения БА. Следует отметить, что гипоксические тренировки применяются для улучшения физической работоспособности, нормализации функций физиологических систем организма, в том числе и при экстремальных условиях. ИГТ используется в качестве дополнения к традиционной терапии различных заболеваний, значимо улучшая их течение, усиливая эффективность лечения, способствуя также ограничению применения медикаментозных препаратов. Однако в настоящее время воздействие интервальной гипоксической тренировки на состояние цикла NO не изучено [8].
Цель исследования. Изучение влияния интервальной гипоксической тренировки (ИГТ) на параметры цикла NO посредством исследования динамики изменений NО3-/NО2- анионов, их суммарной концентрации (Σ NО3-/NО2-), а также 3-нитротирозина (3-НТ) в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) на фоне ИГТ и однократного гипоксического сеанса (ОГС) пациентам с легкой атопической БА.
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 66 пациентов. Установление диагноза осуществлялось согласно GINA (2021) и программе «Бронхиальная астма у детей «Стратегия лечения и профилактика» (2021 г.) [9]. Пациенты с БА легкого течения находились в стадии ремиссии и были разделены на 2 группы: 1-я – с ИГТ, состояла из 24 человек; 2-я – с ОГС – 22 человека. В контрольную группу вошли 20 практически здоровых детей. ИГТ проводилась в течение 21 дня. Используемая вдыхаемая гипоксическая смесь содержала 12% O2. Критерием прекращения ИГТ явилась негативная динамика соотношения SaO2/ЧСС.
КВВ собирался во всех группах обследованных и группе контроля до и после процедур ОГС или курса ИГТ. Оценка клинических проявлений БА проводилась по балльному вопроснику ACQ. В нем учитывались следующие параметры: частота пробуждений из-за симптомов БА, выраженность симптомов утром в момент пробуждения, кашель, свистящее дыхание, одышка, частота использования бронхолитиков короткого действия, ограничение деятельности из-за проявлений заболевания (от 0 до 6 баллов (max 36баллов)) [10]. Концентрация NO2- регистрировалась спектрофотометрически с использованием реактива Грисса, Σ NО3-/NО2- измерялась аналогичным методом после восстановления NO3- до NO2- нитритредуктазой. Уровень 3-нитротирозитна определялся с помощью иммуноферментного анализа.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась традиционными методами математической статистики: определялись средние значения показателей, стандартные отклонения, критерии достоверности Стьюдента (t), критерий Стьюдента для множественных сравнений с поправкой Бонферрони, U-Критерий Манна–Уитни. Исследование зависимостей между изучаемыми параметрами выполнялось с использованием метода наименьших квадратов с вычислением коэффициента корреляции. Значения р<0,05 оценивались как значимые.
Результаты исследования и их обсуждение
В результате проведенного исследования у пациентов с бронхиальной астмой было отмечено:
- достоверное увеличение концентрации Σ NО3-/NО2- и отдельно NО3- в КВВ после курса ИГТ с 7,8 +/– 0,8 µМ до 18,7+/– 5,5 µМ (р=0,034) и с 5,7 +/– 0,8 µМ до 15,4 +/– 5,7 µМ (р=0,025) соответственно по отношению к исходной. Однако достоверных изменений уровня NО2- в КВВ в ходе курса не обнаружено (2,6 +/– 0,7 µМ до 2,1 +/– 0,7 µМ, р=0,06);
- достоверное увеличение уровней Σ NО3-/NО2- и NО3- у этих же пациентов до и после курса ИГТ по сравнению значениями в контрольной группой, р=0,035 (рис. 1).
При этом в группе детей с легкой БА после курса ИГТ отмечалось достоверное снижение клинических проявлений БА с 2,8±0,2 балла до курса до 1,4±0,2 балла (р=0,041).
Однако после цикла ОГС не удалось выявить достоверного снижения концентраций Σ NО3-/NО2- и NО3 в КВВ. Отмечалась лишь тенденция к снижению уровней Σ NО3-/NО2- и NО3 с 10,1 +/– 1,9 µМ до 7,4 +/– 2,3 µМ и с 7,1 +/– 1,7 µМ до 6,3 +/– 1,6 µМ соответственно (р=0,06 и р=0,054). В то же время отмечено достоверное уменьшение уровня нитрит-аниона (2,76 +/– 0,8 µМ до 0,8 +/– 0,48 µМ, р=0,035) (рис. 2).
В контрольной группе средние значения параметров цикла оксида азота до и после курса ИГТ соcтавили: Σ NО3-/NО2- – 3,4 +/– 0,9 µМ и 3,9 +/– 0,8 µМ (р=0,082); NО2- – 1,2 +/–0,4 µМ и 0,98 +/– 0,31 µМ (р=0,065); NО3- – 2,3 +/– 0,4 µМ и 3,0 +/– 0,5 µМ (р=0,078) соответственно срокам в опытных группах. Достоверных отличий между парами параметров обнаружено не было.
Рис. 1. Динамика параметров цикла NO в КВВ у детей с БА в ходе ИГТ
Примечания: * – достоверно по сравнению с контрольной группой
** – достоверно по сравнению с исходным значением
Рис. 2. Параметры цикла NO в КВВ у детей с БА при проведении ОГТ
Примечание: * – достоверно по сравнению с исходным значением
Концентрация 3-нитротирозина в КВВ у всех группа испытуемых оказалась за пределами нижней границы методики определения.
Выявлена положительная корреляционная зависимость между уровнями NO2-, NO3-, Σ NО3-/NО2- в КВВ во всех группах испытуемых (табл. 1, 2, 3).
Таблица 1
Коэффициенты корреляции между параметрами цикла NO в контрольной группе
|
|
Σ NО3-/NО2- |
NО3- |
NО2- |
3-нитротирозин |
|
Σ NО3-/NО2- |
|
0,97 |
0,89 |
– |
|
NО3- |
0,97 |
|
0,87 |
– |
|
NО2- |
0,89 |
0,87 |
|
– |
|
3-нитротирозин |
– |
– |
– |
– |
Таблица 2
Коэффициенты корреляции между параметрами цикла NO в группе пациентов с БА до курса ИГТ
|
|
Σ NО3-/NО2- |
NО3- |
NО2- |
3-нитротирозин |
|
Σ NО3-/NО2- |
|
0,95 |
0,81 |
– |
|
NО3- |
0,95 |
|
0,80 |
– |
|
NО2- |
0,81 |
0,80 |
|
– |
|
3-нитротирозин |
– |
– |
– |
– |
Таблица 3
Коэффициенты корреляции между параметрами цикла NO в группе пациентов с БА после курса ИГТ
|
|
Σ NО3-/NО2- |
NО3- |
NО2- |
3-нитротирозин |
|
Σ NО3-/NО2- |
|
0,91 |
0,77 |
– |
|
NО3- |
0,91 |
|
0,71 |
– |
|
NО2- |
0,77 |
0,71 |
|
– |
|
3-нитротирозин |
– |
– |
– |
– |
Таким образом, в ходе проведенного исследования выявлено, что после курса ИГТ наблюдется более чем 2-кратное увеличение уровней Σ NО3-/ [C1]и отдельно NО2- в КВВ у обследованных детей с легкой БА. При этом в испытуемой группе отмечается улучшение клинического состояния, определяемого по шкалам анкеты ACQ.
Механизмы выявленного изменения уровня метаболитов цикла оксида азота в КВВ могут быть связаны с рядом патофизиологических процессов. В частности, показано, что в ходе процесса адаптации к гипоксии происходит увеличение продукции, связанное с увеличением уровня внутриклеточного Ca2+, что, в свою очередь, может способствовать активации конститутивных, кальцийзависимых NO-синтаз в провоспалительных клетках (преимущественно в эозинофилах), других клетках респираторного тракта. Также отмечено, что длительная гипоксия может усиливать экспрессии гена iNО-синтазы. Продукция NO при этом может возрастать в несколько раз [11, 12].
В ряде работ отмечается, что гипоксические воздействия могут способствовать накоплению NО в так называемом депо. Им в биологических системах могут выступать следующие соединения: S-нитрозотиолы, динитрозольные комплексы железа (ДНКЖ). Показано, что время полураспада этих соединений может варьировать от нескольких часов до нескольких суток, в зависимости от структуры тиола [13]. Помимо этого, роль депо NO могут играть стабильные компоненты цикла NO, такие как нитрит- и нитрат-анионы. При этом показана возможность образования NO в нитрат- и нитритредуктазной компоненте цикла NO [14].
Также отмечено, что при гипоксии наблюдаются накопление свободного железа и увеличение уровня гемоглобина. Это также может быть стимулом для депонирования NO в форме ДНКЖ. Сам гемоглобин способен взаимодействовать с оксидом азота гемом и тиоловыми группами, изменяя баланс реакций цикла NO. Характер ИГТ предполагает смену гипоксического воздействия фазой реоксигенацией, при которой происходит усиление генерации АФК, в том числе и супероксид-анион радикала, который, в свою очередь, стимулирует выход железа из ферритина, способствуя накоплению ДНКЖ [13].
Однако, в отличие от курсовой ИГТ, при проведении пациентам однократного гипоксического сеанса и сбора КВВ непосредственно после процедуры, обнаружены снижение уровня NО2 и тенденция к снижению Σ NО3-/NО2- в КВВ. Полученные данные могут быть объяснены особенностями синтеза оксида азота в организме. Синтез NO представляет собой ферментативную кислородзависимую комплексную окислительную реакцию, катализируемую NO-синтазой. Исходя из этого, снижение Σ NО3-/NО2-в КВВ может быть связано с ингибированием синтеза NO при низком парциальном давлении кислорода во вдыхаемом воздухе.
В исследовании не удалось обнаружить 3-нитротирозин в КВВ ни в одной из изученных групп. Как известно, 3-НТ является продуктом окисления тирозина и образуется, в частности, в реакциях цикла оксида азота при взаимодействии тирозина с пероксинитритом. Уровень последнего критически повышается при развитии оксидативного и нитрозивного стресса из-за усиления генерации NO и супероксид-анион радикала, которые с высокой константой скорости вступают в реакцию с образованием пероксинитрита. Таким образом, изменение уровня 3-НТ может отражать степень развития ОС и НС.
Линейная положительная связь выявлена между параметрами цикла оксида азота в группе контроля и опытных группах. Однако в ряде работ показано, что зависимость NO2- и NO3- теряет линейность с увеличением тяжести заболевания [15]. Таким образом, при легкой БА соотношение параметров цикла оксида азота не нарушено, при этом уровни изученных метаболитов превышают контрольные значения.
Заключение. В результате проведенного исследования выявлено, что интервальная гипоксическая тренировка существенно влияет на цикл NO, меняя соотношение компонентов цикла оксида азота в КВВ, приводя к увеличению концентрации стабильных метаболитов NO при ИГТ и тенденции снижения при ОГС. Таким образом, нам удалось прояснить некоторые особенности цикла NO при ИГТ и ОГС, что способствует расширению применения этих нелекарственных методик в клинической практике.
Исходя из того, что NO является одним из основных регуляторов многих патологических процессов (таких как вазо- и бронхоконстрикция, оксидативный и нитрозивный стресс, воспаление и пр.), изучение влияния условий гипоксии на цикл NO является актуальной задачей и требует дальнейшего развития.