Острые кишечные инфекции являются одной из основных проблем инфекционной заболеваемости. Ежегодно в мире регистрируется более миллиарда случаев заболеваемости острыми кишечными инфекциями, как вирусной, так и бактериальной природы. Среди бактериальных агентов преимущественно встречаются эшерихии, сальмонеллы, шигеллы, кампилобактерии [1]. При этом уровень патологии, связанной с сальмонеллой, относительно высокий во всех странах и на всех континентах. Этому способствуют такие факторы, как внутривидовое разнообразие, глобализация, туризм,нарушение правил хранения и реализации продуктов питания, меняющиеся стереотипы пищевого поведения населения, интенсивный рост международного товарообмена [2]. Но, несмотря на неоспоримые внешние факторы, формирующие эпидемиологический процесс, нельзя не учитывать внутренние факторы, связанные с иммунологической реактивностью организма, определяющие течение и исходы заболевания. К таким факторам относятся регуляторные молекулы воспаления, полиморфизм генов цитокинов.
Цель исследования: определить уровень регуляторных молекул воспаления, установить наличие ассоциации между полиморфизмом гена IL-2 T330G и экспрессией данных пептидов у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией.
Материалы и методы исследования. В исследовании приняли участие 23 пациента, из них женщин 47,8% (11/23), мужчин 52,2% (12/23), средний возраст 28,3 ± 11,6, с диагнозом: сальмонеллёзная инфекция и 20 условно-здоровых добровольца (средний возраст 23,3±1,4). Критерии отбора для включения в исследуемые группы: информированное согласие больных, возраст 15 – 55 лет; отсутствие другой острой патологии на момент исследования и в течение месяца, предшествующего данному заболеванию; отсутствие беременности, периода лактации; отсутствие иммунодефицитных состояний, включая ВИЧ-инфекцию.Критерии исключения из исследования: наличие хронического заболевания в стадии обострения, злоупотребление алкоголем. Определение концентрации провоспалительных цитокинов IL-2, IL-1b, IL-6, ФНО-a, противовоспалительного IL-10 и липополисахарид-связывающего белка (ЛПС-СБ) проводилось методом твёрдофазного ИФА, с использованием набора реактивов ELISA (США) и Вектор-Бест (г.Новосибирск). Определение полиморфизма гена IL-2 T330G осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО «Литех» (г. С-Петербург).Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи электронных программ Microsoft Excel 2010, Statistica 6,0, с определением статистической значимости различий при достигнутом уровне значимости р≤0,05 с использованием критерия Манна–Уитни (U-тест). При расчете корреляционных связей использовали коэффициент Спирмена, r = -1+1 (r=0-0,3 – слабая связь, r= 0,3-0,7 – связь средней силы, r= 0,7-1 – сильная связь; «+» – прямая связь, «-» – обратная связь).Оценка распределения признаков проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилкса W.
Результаты исследования и обсуждение. В период проведения исследования все пациенты находились на стационарном лечение в Краевой клинической инфекционной больнице с диагнозом: Сальмонеллёзная инфекция. Заболевание протекало в гастроинтестинальной форме по гастроэнтеритическому и энтеритическому варианту. При проведении комплексного обследования: путём бактериологического исследования испражнений в 21,7% (5/23) случаев была выделена Sallmonella enteritidis, в 4,3% (1/23) случаев Sallmonella typhimurium и Sallmonella гр. С; в 69,6% (16/23) заболевание установлено при 2-кратном исследовании сыворотки крови методом РПГА при увеличении титра АТ в 4 раза и более. У всех пациентов сальмонеллёзная инфекция регистрировалась в среднетяжёлой форме с умеренно выраженным лихорадочно-интоксикационным синдромом и поражением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в 26,1% (6/23) отмечались явления обезвоживания 1-й степени.Заболевание характеризовалось острым началом с ознобом, повышением температуры до 38,6±0,7◦С, тошнотой, рвотой, болью в мезогастральной области, метеоризмом, в дальнейшем, в течение суток, присоединением характерного зловонного жидкого стула коричнево-зелёного цвета со слизью. В отдельных случаях, отмечалось развитие эксикоза: жажда, сухость во рту, сухость слизистых оболочек, снижение диуреза. В общем анализе крови отмечался лейкоцитоз до 11,6±4,6×109/л, нейтрофилёз до 74% и СОЭ до 10 мм/ч; в копрограмме лейкоциты, стеаторея ++, креаторея ++, слизь +. На фоне проводимой терапии, лихорадка до 37,9±0,8◦С, интоксикация сохранялисьв течение 3 – 4 дней, тошнота и рвота купировались в первые 2 дня, а вот диарея сохранялась в среднем до 4 дней с частотой от 4 - 6 до 15 - 20 раз в сутки и сопровождалась метеоризмом, схваткообразными болями в мезогастральной области. Синдром эксикоза был устранён уже в первые сутки с момента госпитализации. В среднем заболевание протекало 10±3 дней, ивсе пациенты были выписаны из стационара с выздоровлением.
Развитие сальмонеллёза, тяжесть и длительность инфекционного процесса зависят от множества управляемых и неуправляемых факторов: патоген вступает во взаимодействие с такими тремя факторами защиты, как микробиота кишечника, эпителиальный слой кишечника и иммунная система [3,4]. Попадая в тонкий кишечник, под влиянием первичных факторов защиты грамотрицательные бактерии погибают, способствуя высвобождению и накоплению липополисахарида (ЛПС). ЛПС стимулирует TOLR-4 изапускает каскад иммунных реакций, стартуя с образования комплекса ЛПС+ЛПС-СБ, что является сигналом для индукции и экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов [5,6]. Немаловажное значение иммунопатогенеза в развитии и течении инфекционного процесса при сальмонеллёзной инфекции послужило поводом для определения уровня воспалительных пептидов. В результате, у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией, средней степени тяжести отмечалось повышение уровня ЛПС-СБ до 4423 [4221-6078] мг/мл, IL-2 – до 13,44 [12,19-15]пг/мл, ФНО-α –до 1,79 [0,99-2,93]пг/мл и IL-10 –до 5,17 [0-10,1]пг/мл (р≤0,01). Уровень IL-1b и IL-6 не превышал показателей нормы, р≥0,05 в сравнении с группой контроля (табл.1).
Таблица 1
Цитокиновый профиль и уровень ЛПС-СБ у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией
|
|
ЛПС-СБ, мг/мл |
IL-2 пг/мл |
IL-10 пг/мл |
IL-1β пг/мл |
IL-6 пг/мл |
ФНО-α пг/мл |
|
Сальмонеллёзная инфекция (n=23) |
4423 [4221-6078] р≤0,01 Uэмп=91 |
13,44 [12,19-15]
р≤0,01 Uэмп=60 |
5,17 [0-10,1]
р≤0,01 Uэмп=92 |
0 [0-1,13]
р≥0,05 Uэмп=167 |
1,34 [0-5,38]
р≥0,05 Uэмп=157 |
1,79 [0,99-2,93] р≤0,01 Uэмп=58 |
|
Контроль (n=20) |
4177 [3880-4868] |
7,959 [3,979-8,561] |
0 [0-0] |
1,046 [0,409-1,613] |
0,178 [0-1,511] |
0 [0-0,382] |
Примечание: p– уровень статистической значимости в сравнении с группой контроля, (непараметрический метод Манна-Уитни - U – критерий; медиана, интерквартильный интервал между 25 и 75 процентилями).
Выявленные изменения являются закономерными, отображая стадии иммунопатогенеза. В процессе жизнедеятельности сальмонелл накапливаются патогены, архитипом которых является ЛПС (эндотоксин),активирующие моноцитарно-макрофагальную систему иинициирующие сложный каскад прямой и обратной индукции, репрессии транскрипционных факторов и аутокринных регуляторов [7,8]. Сальмонеллы, попадая в макроорганизм, стимулируют CD4+клетки, первичноиндуцируя экспрессию IL-2.IL-2, являясь плейотропным цитокином, взаимодействует непосредственно или косвеннос различными популяциями клеток, определяя продукцию иммунорегуляторных пептидов [9,10].Под влиянием IL-2 стимулируется пролиферация Т-, В- и NK-клеток, синтез интерлейкинов, в том числе ФНО-a, IL-6, IL-10 и самого себя. При сальмонеллёзной инфекции отмечено повышение уровня ЛПС-СБ,IL-2, ФНО-a, что характерно для реализации эффекторных механизмов защиты с целью быстрой элиминации антигена и IL-10, отвечающего за регуляторный эффект и формирование гуморального иммунитета.
IL-1 и IL-6 относятся к группе провоспалительных цитокинов, активно участвующих в острофазовых проявлениях общей и местной воспалительной реакции. Например, синтез IL-1 является стартовым моментом в антибактериальной защите[11]. Именно они ответственны за лихорадочно-интоксикационный синдром: пирогенная реакция, нарушение сна, аппетита. Местное действие основано на повышение проницаемости сосудов, привлечении в очаг макрофагов, моноцитов, лейкоцитов с дальнейшей стабилизацией, ограничением очага воспаления. При этом, гиперпродукция цитокинов приводит к развитию системной воспалительной реакции, вовлечению отдаленных органов, что может служить причиной ряда патологических состояний, в частности, септического шока и полиорганнойнедостаточности [12]. У пациентов, с данным вариантом течения сальмонеллёзной инфекции, не зафиксировано значительного всплеска IL-1b и IL-6 в результате того, что заболевание протекало в нетяжёлой форме с умеренно выраженной симптоматикой и благоприятным исходом.
Но, необходимо учитывать, что при инфицировании одним и темже патогеном, клиническая картина заболевания и исходы могут значительно различаться. Так, сальмонеллёзная инфекция в гастроинтестинальной форме может иметь течение от лёгкого до тяжёлого с вариабельностью исходов и возможными осложнениями, что определяется балансом между цитокинами, стимулирующими иммунный ответ и контролируется полиморфизмом генов цитокинов[13]. Отсюда, любые генетические варианты, влияющие на баланс цитокинов и формирующийся, в результате, иммунный профиль индивидуума, возможно являются основным фактором в течении сальмонеллёза. Учитывая, что IL-2является основополагающим в развитии инфекционного процесса, то мутации локусов данного гена могут играть ведущую роль в онтогенезе заболевания. Исходя из этого, в продолжение исследования было определено наличиеассоциациимежду полиморфизмом гена IL-2 T330Gи уровнем продукции ЛПС-СБ, IL-2, IL-6, ФНО-a, IL-1b и IL-10 среди больных сальмонеллёзной инфекцией. Все пациенты, согласно генотипу, подразделены на 3 подгруппы: первую подгруппу составили носители мажорного аллеля Т в варианте -330ТТ, вторая подгруппа – носители генотипа -330TGи в третью подгруппу вошли обладатели гипопродуктивного аллеля G вариант-330GG. Среди носителей минорного аллеля G отмечена достоверно более низкая концентрация плейотропных цитокинов: IL-2, IL-6. Уровень IL-2 во 2 подгруппе фиксировался в пределах 13,44 [12,19-15,0]пг/мл, в 3 подгруппе – в пределах 11,87 [11,25-12,19]пг/мл, а это достоверно ниже показателей 14,01 [12,5-15,31]пг/мл группы носителей дубля гиперпродуктивного аллеля Т. Концентрация IL-6 у больных с генотипом -330TG составляла 1,35 [0-4,17]пг/мл, с генотипом -330GG–1,97 [0-4,3]пг/мл в сравнении с носителями генотипа -330ТТ 1,97 [0,54-4,66]пг/мл, р≤0,05. Остальные показатели не отличались от группы сравнения, р≥0,05 (таб. 2).
Таблица 2
Концентрация ЛПС-СБ и цитокинов в зависимости от полиморфизма гена IL-2 T330G
|
Показатели |
TT 330 n=8 |
TG330 n=10 |
GG330 n=5 |
|
ЛПС-СБ,мг/мл |
5533 [4594-6108] |
5351 [4221-6078] р≥0,05 Uэмп=29 |
5836 [5356-7051] р≥0,05 Uэмп=19 |
|
IL-2,пг/мл |
14,01 [12,5-15,31] |
13,44 [12,19-15] р≤0,05 Uэмп=20 |
11,87 [11,25-12,19] р≤0,05 Uэмп=1 |
|
IL-10,пг/мл |
6,9 [0,69-10,25] |
5,17 [0-9,8] р≥0,05 Uэмп=25,5 |
7,59 [0,69-10,25] р≥0,05 Uэмп=12 |
|
IL-1β,пг/мл |
0 [0-1,6] |
0 [0-1,13] р≤0,05 Uэмп=20 |
0 [0-1,6] р≥0,05 Uэмп=15,5 |
|
IL-6,пг/мл |
1,97 [0,54-4,66] |
1,35 [0-4,17] р≤0,05 Uэмп=17 |
1,97 [0-4,3] р≤0,05 Uэмп=7 |
|
ФНО-α,пг/мл |
1,95 [1,3-2,93] |
1,79 [0,81-2,76] р≥0,05 Uэмп=25 |
1,95 [1,3-2,93] р≥0,05 Uэмп=17 |
Примечание: p - уровень достоверности в сравнении с группой пациентов, носителей полиморфного гена IL-2 -330ТТ, (непараметрический метод Манна-Уитни - U – критерий; медиана, интерквартильный интервал между 25 и 75 процентилями).
Более низкий уровеньIL-2 среди носителей гипопродуктивного аллеля G обусловлен тем, что данная мутация (-330 TG) расположена в промоторной зоне гена IL-2 и участвует в индукции и экспрессии интерлейкина 2, определяя его конценрацию [14]. В научной литературе имеются данные, что IL-2 является адъювантом цитокинов и при гиперпродуктивном варианте способен утяжелять течение заболевания, тогда как дефицитные по IL-2 клетки более эффективны в разрешении воспалительного процесса и раннем формировании иммунитета [10,15]. Таким образом, полиморфизм гена IL-2 -T330G задействован в индукции экспрессии непосредственно IL-2 и опосредовано IL-6. Низкая продукция IL-6 в клинической картине может проявляться, в первую очередь, слабо выраженными общеинфекционными симптомами, что, несомненно, облегчает состояние больного в остром периоде, но может неблагоприятно отражаться в исходе, приводя к затяжному течению, хронизации процесса и формированию бактерионосительства. Дело в том, что IL-6–это провоспалительный цитокин, который можно отнести к группе цитокинов гуморального неспецифического иммунитета. В результате стимуляции IL-2 Т-лимфоциты, макрофаги и моноциты продуцируют IL-6, который оказывает множественное влияние на клетки иммунной защиты. Например, IL-6 усиливает созревание и дифференцировку В-лимфоцитов и индуцирует выработку иммуноглобулинов, необходимых для завершения инфекционного процесса и формирования иммунитета. При полиморфизме гена IL-2 в локусе -T330G между лимфокинами IL-2 иIL-6 установлена прямая зависимость средней силы. У носителей генотипа -330ТТ и -330ТGкорреляционная связь определялась в пределах 0,3, при варианте -330 GGкорреляция составляла 0,5. То есть, уровень продукции IL-6 зависит от концентрации IL-2, чем выше показатели IL-2, тем выше экспрессия IL-6 (таб 3).
Таблица 3
Корреляция междуIL-2иIL-6, IL-10, ФНО-a в зависимости от полиморфизма гена IL-2 -T330G
|
генотипы |
IL-2 |
IL-6 |
|
генотип-330 TT n=8 |
14,01 [12,5-15,31] |
0,31 |
|
генотип-330 TG n=10 |
13,44 [12,19-15] |
0,336 |
|
генотип-330 GG n=5 |
1,97 [0-4,3] |
0,5 |
цитокиныСледовательно, у пациентов с сальмонеллёзной инфекцией, гастроинтестинальной формой, среднетяжёлым течением, заболевание протекает с закономерно высокой экспрессией ЛПС-СБ, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. При этом, синтезотдельных молекул воспаления напрямую зависит от полиморфизма гена IL-2 T330G, что с высокой степенью вероятности может определять течение и исход заболевания.
Выводы
Для сальмонеллёзной инфекции, гастроинтестинальной формы, средней степени тяжести, в разгар заболевания характерно повышение концентрации ЛПС-СБ, IL-2, ФНО-a, IL-10. При этом, для носителей минорного аллеля G полиморфизма T330G в промоторной зоне гена IL-2 характерна гипопродукцияIL-2 и IL-6, в отличие от носителей гомозиготного варианта -330ТТ, с прямой корреляционной связью средней силы.