Актуальность внебольничных пневмоний на современном этапе гражданской и военной медицины обусловлена высоким уровнем заболеваемости среди пациентов призывного возраста, тяжестью клинического течения, длительной утратой трудоспособности, склонностью к эпидемическому распространению и увеличивающимися летальными исходами на фоне эпидемий [1, 2].
Военный призыв является мощным стрессорным фактором, который может приводить к развитию синдрома хронического адаптационного перенапряжения и, как следствие, к дисбалансу различных систем организма, в том числе и иммунной системы[3].
При встрече макроорганизма с инфекционным агентом происходит активация иммунной системы (врожденный иммунитет), которая запускает каскад провоспалительных реакций, регулируемых цитокинами, направленных на элиминацию патогена. Через TLR (толл-рецепторы) одновременно происходит запуск противовоспалительных сигналов, что вызывает усиление экспрессии антивоспалительных интерлейкинов (IL-10, IL-4, IL-13) и других регуляторных молекул, необходимых для купирования воспалительного процесса [4].
Доказано, что IL-10 является ключевым регулятором иммунного ответа при вирусных инфекциях. Анализ структуры его рецепторной системы свидетельствует об идентичном с IFN-α и IFN-γ пути проведения (Jak-STAT) сигнала, кроме того, они активируют одни и те же транскрипционные факторы комплекса рецепторов 2-го типа, приводящие к экспрессии гена [5, с. 328].
В связи с пандемией COVID-19 большое количество научных работ посвящено изучению роли генетического полиморфизма различных белков, в том числе и участвующих в патогенетических механизмах осложненного течения вирусных заболеваний, однако влияние полиморфизма гена IL10, на наш взгляд, недостаточно отображено при течении внебольничных пневмоний у пациентов призывного возраста.
Цель исследования – определить влияние полиморфизма IL10-1082G>А на экспрессию IL-10 у пациентов призывного возраста с внебольничными пневмониями.
Материалы и методы исследования
Исследования проводились в период с 2020 по 2023 гг. в НИИ «Молекулярная медицина» при ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, клинико-диагностической лаборатории и инфекционном отделении ВГУЗ «321 Окружной военный клинический госпиталь» (г. Чита).
Проведено клиническое обследование 160 неродственных пациентов русской национальности в возрасте 18–20 лет с внебольничными пневмониями. Первая группа представлена 80 пациентами призывного возраста с COVID-19-инфекцией, осложненной нетяжелой пневмонией (n=40) и тяжелой пневмонией (n=40). Вторая группа – группа клинического сравнения (n=80) – пациенты призывного возраста с острой респираторной инфекцией (ОРИ) негриппозной этиологии, осложненной нетяжелой пневмонией (n=40) и тяжелой пневмонией (n=40). Контрольную группу составили 86 практически здоровых мужчин призывного возраста, сопоставимых по месту проживания и национальности.
Критерии исключения: наличие родственных связей; пациенты с острыми и/или хроническими сопутствующими заболеваниями, другими патологическими состояниями/травмами. Кроме того, из исследования исключались пациенты и резиденты, получающие противовирусную, антибактериальную, дезагрегационную и антикоагуляционную терапию перед госпитализацией.
Формирование групп пациентов проводилось согласно клиническим рекомендациям Минздрава России. Клинические группы больных с внебольничными пневмониями были сопоставимы по полу, возрасту, классификационным, диагностическим характеристикам и проводимому лечению [6].
Этиологическую расшифровку возбудителей внебольничных пневмоний осуществляли с помощью ПЦР назофарингиальных мазков и мокроты для обнаружения РНК/ДНК вирусов, бактерий, атипичных патогенов [3]. Генетические исследования для определения мутации IL10-1082G>А осуществляли, используя набор праймеров «Литех»-«SNP» (Россия). Концентрацию IL-10 в сыворотке крови устанавливали с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) методом иммуноферментного анализа.
Клинические, лабораторные и инструментальные исследования выполняли при поступлении пациентов в стационар. Компьютерная томография (КТ) органов грудной клетки производилась всем пациентам при поступлении в стационар. В последующем, с целью динамического наблюдения за течением инфекционного процесса, исследование выполнялось с интервалом в 10 дней. Протокол КТ формировался по стандартным правилам, принятым при описании данных, а также с применением стандартизованных экспресс-форм протоколов [7]. В условиях большого потока пациентов, для быстрой оценки изменений в легких после проведения КТ, использовалась «эмпирическая» визуальная шкала, основанная на визуальной оценке примерного объема уплотненной легочной ткани в легком с наибольшим поражением [8]: 1) отсутствие характерных проявлений (КТ-0); 2) минимальный объем / распространенность <25% объема легких (КТ-1); 3) средний объем / распространенность 25–50% объема легких (КТ-2); 4) значительный объем / распространенность 50–75% объема легких (КТ-3); 5) субтотальный объем / распространенность >75% объема легких (КТ-4).
В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2013 – поправки) и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.
Статистическая обработка результатов исследования осуществлялась с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics Version 25.0 (лицензия № Z125-3301-14, IBM, США). При проведении статистического анализа авторы руководствовались принципами Международного комитета редакторов медицинских журналов (ICMJE) и рекомендациями «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе» (SAMPL). Оценку нормальности распределения признаков проводили с помощью W-критерия Шапиро–Уилка. С учетом распределения признаков, отличного от нормального, интервальные данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей (Me [Q1; Q3]). Статистическую значимость различий показателей между группами оценивали путем определения U-критерия Манна–Уитни и уровня значимости p. Во всех случаях р<0,05 считали статистически значимым. Оценку статистической значимости различий номинальных показателей исследования проводили с использованием критерия χ2 Пирсона. Зависимость относительных показателей оценивали путем сравнения полученного значения критерия χ2 с критическим (определяли уровень значимости p) [9].
Результаты исследования и их обсуждение
При клиническом наблюдении за пациентами зарегистрировано, что все они выписаны из стационара с полным разрешением как клинических проявлений, так и изменений в легких при контрольных КТ. Применение «эмпирической» визуальной шкалы обосновано, так как адаптированная шкала валидирована путем доказательства наличия статистически значимой тенденции направленного изменения доли умерших пациентов среди различных категорий КТ0 – КТ4 [10]. Данные визуализации интерпретировались только в контексте клинической картины и результатов лабораторно-инструментальных показателей, так как доказано, что КТ играет важную, но не определяющую роль в оценке тяжести течения заболевания и прогнозе его развития. Эти ограничения связаны в том числе с отсутствием характеристик поражения легочной ткани («матовое» стекло и/или консолидация) и других проявлений патологии (плевральный выпот, отек легких и др.). Поэтому объем поражения легких при КТ может не иметь прямой корреляции с клинической тяжестью заболевания [7].
При определении встречаемости аллелей и генотипов гена IL10-1082G>А у пациентов с внебольничными пневмониями и группой контроля зарегистрировано отсутствие статистической значимости различий (табл. 1).
Таблица 1
Частота SNP IL10-1082(G>A) у пациентов призывного возраста с внебольничными пневмониями (χ2, df=1)
|
|
Аллель G OR [95% CI] |
Аллель A OR [95% CI] |
Генотип GG OR [95% CI] |
Генотип GA OR [95% CI] |
Генотип AA OR [95% CI] |
|
Контроль (n=86) |
0,378 |
0,622 |
0,151 |
0,453 |
0,395 |
|
COVID-19 (n=80) χ2 р |
0,413 1,2 [0,7–1,8] |
0,588 0,9 [0,6–1,3] |
0,150 1,0 [0,4–2,3] |
0,525 1,3 [0,7–2,5] |
0,325 0,7 [0,4–1,4] |
|
0,42 0,52 |
1,0 0,61 |
||||
|
ОРИ (n=80) χ2 р |
0,363 0,9 [0,6–1,5] |
0,638 1,1 [0,7–1,7] |
0,100 0,6 [0,2–1,6] |
0,525 1,3 [0,7–2,5] |
0,375 0,9 [0,5–1,7] |
|
0,08 0,77 |
0,09 0,77 |
||||
Примечание: p – различия значимы с контролем.
При анализе частоты распространенности SNP IL10-1082(G>A) у пациентов в зависимости от тяжести течения внебольничных пневмоний отмечена значимая частота преобладания -1082А- аллеля и -1082А/А генотипа у пациентов как с COVID-19, так и с ОРИ, осложненной тяжелой пневмонией (табл. 2, 3), тогда как при сравнении частоты носительства изучаемого полиморфизма гена IL10 между группами с тяжелым течением внебольничных пневмоний такой значимости не отмечено (р>0,05).
Таблица 2
Частота SNP IL10-1082(G>A) у пациентов призывного возраста с COVID-19, осложненной нетяжелой и тяжелой внебольничной пневмонией (χ2, df=1)
|
|
Аллель G OR [95% CI] |
Аллель A OR [95% CI] |
Генотип GG OR [95% CI] |
Генотип GA OR [95% CI] |
Генотип AA OR [95% CI] |
|
Контроль (n=86) |
0,378 |
0,622 |
0,151 |
0,453 |
0,395 |
|
COVID-19, нетяжелая пневмония (n=40), χ2 р |
0,550 2,0 [1,2–3,4] |
0,450 0,5 [0,3–0,9]
|
0,200 1,4 [0,5–3,7] |
0,700 2,8 [1,3–6,3] |
0,100 0,2 [0,1–0,5]
|
|
6,59 0,01 |
11,41 0,003 |
||||
|
COVID-19, тяжелая пневмония (n=40), χ2 р p1 |
0,275 0,6 [0,4–1,1] |
0,725 1,6 [0,9–2,9] |
0,100 0,6 [0,2–2,1] |
0,350 0,7 [0,3–1,4] |
0,550 1,9 [0,9–4,0] |
|
2,56 0,11 0,001 |
2,69 0,26 0,001 |
||||
Примечание: p – различия значимы с контролем; p1 – различия значимы с группой нетяжелой внебольничной пневмонии.
Таблица 3
Частота SNP IL10-1082(G>A) у пациентов призывного возраста с ОРИ, осложненной нетяжелой и тяжелой внебольничной пневмонией (χ2, df=1)
|
|
Аллель G OR [95% CI] |
Аллель A OR [95% CI] |
Генотип GG OR [95% CI] |
Генотип GA OR [95% CI] |
Генотип AA OR [95% CI] |
|
Контроль (n=86) |
0,378 |
0,622 |
0,151 |
0,453 |
0,395 |
|
ОРИ, нетяжелая пневмония (n=40), χ2 р |
0,450 1,4 [0,8–2,3] |
0,550 0,7 [0,4–1,3]
|
0,100 0,6 [0,2–2,1] |
0,700 2,8 [1,3–6,3] |
0,200 0,4 [0,2–0,9]
|
|
1,18 0,28 |
6,78 0,03 |
||||
|
ОРИ, тяжелая пневмония (n=40), χ2 р p1 |
0,288 0,7 [0,4–1,2] |
0,712 1,5 [0,9–2,7]
|
0,125 0,8 [0,3–2,4] |
0,325 0,6 [0,3–1,3] |
0,550 1,9 [0,9–4,0]
|
|
1,96 0,16 0,03 |
2,69 0,26 0,002 |
||||
Примечание: p – различия значимы с контролем; p1 – различия значимы с группой нетяжелой внебольничной пневмонии.
Определение содержания кодируемого белка (IL-10) у исследуемых групп осуществили следующим этапом. Показано, что при сравнении его уровня между исследуемыми группами регистрировалось увеличение во второй группе в 51 раз по сопоставлению с аналогичным значением группы контроля и в 2,7 раза по сравнению с группой клинического сравнения (табл. 4).
Таблица 4
Содержание IL-10 у пациентов призывного возраста с внебольничными пневмониями и практически здоровых лиц, Mе [Р25-Р75]
|
Параметр |
Исследуемые группы |
||
|
Контроль (n=86) |
COVID-19 (n=80) |
ОРИ (n=80) |
|
|
IL-10 (пг/мл) |
0,17 [0,01; 3,43] |
8,72 [4,0; 14,82] H=0, р<0,001
|
3,20 [1,04; 8,0] H=198, р<0,001 H=602, р1<0,001 |
Примечание: р – различия значимы с контролем; р1 – различия значимы с первой группой.
При анализе концентрации IL-10 у пациентов с внебольничными пневмониями в зависимости от тяжести течения отмечен его более высокий уровень в группах с тяжелой пневмонией (табл. 5, 6).
Таблица 5
Содержание IL-10 у пациентов призывного возраста в зависимости от тяжести внебольничной пневмонии на фоне COVID-19, Mе [Р25-Р75]
|
Параметр |
Исследуемые группы |
||
|
Контроль (n=86) |
COVID-19 с нетяжелой пневмонией (n=40) |
COVID-19 с тяжелой пневмонией (n=40) |
|
|
IL-10 (пг/мл) |
0,2 [0,01; 3,4] |
6,4 [4,0; 10,4] H=0, р<0,001 |
11,5 [8,5; 14,8] H=0, р<0,001 H=56, р1<0,001 |
Примечание: р – различия значимы с контролем; р1 – различия значимы с группой нетяжелой внебольничной пневмонии.
Таблица 6
Содержание IL-10 у пациентов призывного возраста в зависимости от тяжести внебольничной пневмонии на фоне ОРИ негриппозной этиологии Mе [Р25-Р75]
|
Параметр |
Исследуемые группы |
||
|
Контроль (n=86) |
ОРИ с нетяжелой пневмонией (n=40) |
ОРИ с тяжелой пневмонией (n=40) |
|
|
IL-10 (пг/мл) |
0,2 [0,01; 3,4] |
1,9 [1,04; 4,1] H=190, р<0,001 |
5,8 [2,4; 8,0] H=8, р<0,001 H=74, р1<0,001 H=0, р2<0,001 |
Примечание: р – различия значимы с контролем; р1 – различия значимы с группой нетяжелой внебольничной пневмонии; р2 – различия значимы с группой тяжелой внебольничной пневмонии COVID-19.
Кроме того, зафиксировано, что у пациентов с тяжелой пневмонией на фоне COVID-19 выявляется более высокое значение IL-10 (2 раза) по сопоставлению с тяжелой пневмонией на фоне ОРИ негриппозной этиологии (р<0,001).
При изучении влияния SNP IL10-G-1082A на синтез кодируемого цитокина отмечено снижение его уровня при носительстве генотипа -1082А/А во всех исследуемых группах (табл. 7).
Таблица 7
Содержание в крови IL-10 у пациентов с внебольничными пневмониями и практически здоровых лиц в зависимости от генотипа полиморфизма гена IL10-G-1082A, пг/мл (Mе [Р25-Р75])
|
|
Генотип G/G |
Генотип G/A |
Генотип A/A |
|
Контроль (n=86) |
1,33 [1,01; 2,01] (n=13) |
0,33 [0,21; 0,48] (n=39) р=0,001 |
0,01 [0,01; 0,03] (n=34) р=0,001 р1=0,006 |
|
COVID-19 (n=80) |
13,15 [12,88; 13,59] (n=12) |
9,41 [7,55; 10,82] (n=42) р=0,0001 |
6,0 [4,59; 7,3] (n=26) р=0,0001 р1=0,0001 |
|
ОРИ (n=80) |
7,68 [7,35; 7,96] (n=8) |
3,29 [3,08; 5,32] (n=42) p=0,0001 |
2,23 [1,94; 2,78] (n=30) p=0,0001 р1=0,0001 |
Примечание: р – различия значимы с -1082G/G; р1 – различия значимы с -1082G/A.
SARS-CoV-2 имеет 73% гомологии с SARS-CoV, и, подобно SARS-CoV, патогенез пневмонии, вызванной SARS-CoV-2, вероятно, протекает в две фазы: сначала вирусная фаза характеризуется репликацией вируса, приводящей к прямому вирус-опосредованному повреждению тканей.Степень этого повреждения определяет патогенез вторичной фазы, которая характеризуется привлечением эффекторных иммунных клеток, вызывающих местную и системную воспалительную реакцию, которая может сохраняться даже после устранения вируса.Развитие легочных заболеваний связано с избыточной проницаемостью сосудов, приводящей к отложению микротромбов и повышению проницаемости сосудов, в дополнение к ряду системных симптомов. Хотя было выявлено несколько факторов риска тяжелой формы COVID-19, патофизиологические основы, которые способствуют тяжести заболевания, до конца не изучены [4].
Отмечено, что врожденные иммунные реакции модулируются инфекцией SARS-CoV-2. Избыточное выделение провоспалительных цитокинов вместе с лимфопенией, дисфункцией лимфоцитов и гранулоцитарными и моноцитарными аномалиями являются важными отличительными признаками в патогенезе тяжелой формы COVID-19.Более того, аномальные нейтрофилы, с точки зрения как фенотипа, так и функциональности, такие как образование внеклеточных ловушек (NET) нейтрофильных клеток, дендритные клетки (DC), в основном обычные DC типа 2 (cDC2) и плазмоцитоидные DC (pDC), а также клетки естественных киллеров (NK), влияют на тяжесть инфекций SARS-CoV-2.Также обнаружено, что дисфункция моноцитов и макрофагов (определяемая профилями экспрессии HLA-DR и FCN1 (фиколин 1) и SPP1 (секретируемый фосфопротеин 1)) влияет на тяжесть COVID-19 соответственно, как и значимое увеличение концентрации провоспалительных цитокинов и хемокинов.Наконец, отсутствие противовирусного ответа, опосредованного интерфероном (e.г. IFN (типы I и III)) в начале заболевания может повышать риск инфицирования [C1][11].
Неспособность обеспечить своевременный и эффективный иммунный ответ против SARS-CoV-2 является многофакторной и, возможно, зависит от: вирусной нагрузки (точный вклад вирусной нагрузки в течение заболевания установить трудно, и до сих пор не ясно, насколько это влияет на исход заболевания); дефектов реакции на IFN I типа (своевременная выработка IFN I типа клетками-хозяевами имеет решающее значение для ограничения репликации вируса и укрепления противовирусного иммунитета); несбалансированного адаптивного иммунитета за счет снижения количества DC и глубокой Т-клеточной лимфопении, вызванных секвестрацией Т-клеток в тканях или апоптозом Т-клеток в результате действия увеличения провоспалительных цитокинов и снижения противовоспалительных цитокинов (часто встречаются у тяжелых пациентов и могут способствовать дефектному Т-клеточно-опосредованному клиренсу вируса).Было показано, что дефекты иммунных реакций 1-го типа и избыточный иммунитет 2-го типа коррелируют с тяжелым течением COVID-19, что позволяет предположить, что неадаптированный адаптивный иммунный ответ на вирус также может приводить к задержке выведения вируса и прогрессированию заболевания [4].
Тяжелая пневмония вызывает более сильное воспаление из-за индуцированного иммунного ответа. Установлено, что повышенное количество лейкоцитов и увеличение уровней цитокинов и хемокинов и других факторов в крови наблюдаются у пациентов, инфицированных вирусами. Уровни провоспалительных цитокинов, в том числе и IL-10, выше у пациентов с тяжелым течением пневмоний, что согласуется с результатами, полученными в процессе наших изысканий [12].
Заболеваемость COVID-19 значительно различается между странами и континентами. До сих пор этому наблюдению не было четкого объяснения. Эпидемиологические исследования продемонстрировали большое различие в показателях инфицирования и смертности между мужчинами и женщинами. Это может быть связано с гендерным различием полиморфизма генов, сцепленных с Х-хромосомой, которые играют важную роль в иммунном ответе. Кроме того, заболевание может иметь разную степень тяжести: от бессимптомного течения и легких симптомов до опасного для жизни состояния, требующего госпитализации в отделение интенсивной терапии и искусственной вентиляции легких. С тяжестью COVID-19 связано несколько факторов, таких как пожилой возраст, множественные коморбидные заболевания, курение, гиперхолестеринемия и др. Однако мы наблюдаем тяжелое заболевание и у пациентов, не имеющих вышеуказанных факторов риска. Тяжелые формы COVID-19 стали регистрироваться и у детей, включая младенцев. В связи с этим представляется актуальным сфокусировать проблему на генетических факторах, таких как носительство однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), способных влиять на восприимчивость к инфекции и вариабельность тяжести заболевания [12, 13].
Установлено, что в пределах промоторной области, контролирующей транскрипцию гена IL-10, расположены три однонуклеотидных полиморфизма в позициях 1082 (от G до A), 819 (от C до T) и 592 (от C до А), которые, как было показано, влияют на экспрессию IL-10 и могут быть связаны с тяжелым течением и высоким уровнем летальности [14].
При анализе данных о результатах генотипирования, полученных в 98 странах, показана зависимость между частотой встречаемости полиморфизмов генов HLA-B и генов цитокинов (IL-6, IL-10, IL-12B) с показателями уровня смертности от COVID-19 в этих странах. В частности, установлена такая зависимость между частотой носительства полиморфизма генов IL-6(174С), IL-10(592С), IL-10(819C), IL-10(1082G), IL-12(1188A) и летальностью [15].
Таким образом, вариабельность фенотипических проявлений полиморфизмов генов у пациентов с вирусными пневмониями, в том числе и COVID-19, требует дальнейшего всестороннего изучения и систематизации. Результаты таких изысканий могут оказать значимую помощь в создании персонализированного алгоритма лечения данной группы больных.
Выводы
1. У пациентов призывного возраста с внебольничными пневмониями регистрируется повышение концентрации IL-10 с наибольшими значениями в группе с тяжелыми пневмониями при COVID-19.
2. Носительство генотипа -1082А/А гена IL10 характеризуется низким содержанием IL-10 в сыворотке крови.
3. Аллель -1082А- и генотип -1082А/А гена IL10 ассоциируются с тяжелым течением внебольничных пневмоний у пациентов призывного возраста независимо от этиологии.