Прежде всего, отметим факт существования проблемы многоядерных клеток [1-3] различного происхождения, широко представленной в научной литературе и охватывающей комплекс многочисленных [3-5], в том числе теоретических, аспектов и непосредственно касающейся актуальных прикладных задач [5]. При этом немаловажно, что существуют, в частности, многоядерные клетки макрофагального происхождения [6], поскольку их формирование отмечается при патологических процессах, определяющих развитие обширного ряда распространенных заболеваний [5]. К ним можно причислить гранулематозные заболевания различной этиологии, поскольку в их патогенезе велико значение многоядерных макрофагов, и среди этих нозологий особенно выделяется обладающий социальной значимостью туберкулезный гранулематоз, исследование патогенеза которого представляет собой весьма актуальную проблему [6].
Несомненно, что изучение механизмов мультинуклеации макрофагов способствует успешному решению прикладных задач разработки методов терапевтической коррекции и диагностики заболеваний, в патогенезе которых полинуклеарные макрофаги играют ведущую роль. Последний аспект связан с тем фактом, что в условиях туберкулезного гранулематоза многоядерные макрофаги обладают высоким уровнем цитофизиологической активности в отношении продукции провоспалительных цитокинов, активных форм кислорода и выраженной фагоцитозной способностью, существенно превосходя в этом плане мононуклеарные макрофаги [6].
Известно, что многоядерные макрофаги формируются за счет клеточного слияния и амитотического деления ядра, которое по сравнению с клеточной фузией имеет второстепенное значение в мультинуклеации макрофагов в патологических условиях, но клеточное слияние преимущественно обеспечивает образование макрофагальных клеточных производных, включая гигантские многоядерные полинуклеары, присутствующие в очагах хронического воспаления [5].
Вследствие того что реакции клеточного слияния осуществляются при посредстве цитокинов, контролирующих клеточную фузию, то необходимо привести следующий факт. Процесс образования многоядерных клеток обеспечивается различными медиаторами [7], но, несмотря на то, что цитокины имеют полифункциональное значение, вполне возможно указать их роль в клеточной фузии. В частности, индукторами мультинуклеации являются IFN-γ и TNF-α [7]. Также требуется отметить значение молекул клеточной адгезии [8], поскольку, например, β1 и β2 интегрины экспрессируются на сливающихся макрофагах [9]. Иными словами, молекулы клеточной поверхности играют важную роль в реакциях клеточного слияния, напрямую обусловливая реализацию такового и представляя вместе с цитокинами необходимый компонент рассматриваемого процесса, детерминирующего мультинуклеацию макрофагов [5].
Цель работы – изучить в условиях БЦЖ-гранулематоза характер экспрессии у разнящихся по классам ядерности макрофагов цитокинов и молекул клеточной поверхности, играющих роль в клеточном слиянии, обусловливающем образование многоядерных макрофагов, имеющих значение в гранулемогенезе.
Материалы и методы исследования. Объектом исследования являлись культуры клеток перитонеального транссудата мышей-самцов линии BALB/c. Контрольная группа сформирована из культур перитонеальных клеток, выделенных от интактных мышей линии BALB/c. Экспериментальная группа была представлена культурами перитонеальных клеток, выделенных от БЦЖ-инфицированных мышей той же линии через 3 месяца (период формирования гранулем) после внутрибрюшинного введения им вакцины БЦЖ в дозе 0,5 мг в 0,25 мл изотонического водного раствора NaCl [6]. Животных содержали при свободном доступе к воде и пище. Мышей выводили из эксперимента методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом [6]. Время инкубации перитонеальных клеток in vitro (при 37°С) составляло 48 часов. Использовали культуральную среду 199 (106 клеток в 2 мл среды). Фиксация клеточных культур проводилась 4%-ным водным раствором формальдегида.
Цитологические препараты культур перитонеальных клеток анализировали с помощью методов световой микроскопии при увеличении в 400 раз. Определяли относительную численность (%) бинуклеарных и собственно многоядерных макрофагов (с 3 и более ядрами), а также макрофагов с цитоморфологическими признаками амитотического деления клеточных ядер, клеточного слияния и с иммуноцитохимическими признаками экспрессии TNF-a, IFN-g и интегринов-β1 и -β2, принимая за 100% число клеток с соответствующими признаками в пределах каждого класса ядерности. Анализ экспрессии TNF-a, IFN-g и интегринов-β1 и -β2 у макрофагов осуществляли непрямым иммуноцитохимическим методом с использованием диагностических наборов моноклональных антител.
В процессе статистической обработки результатов проведенного исследования оценивали величины средней арифметической и ее стандартной ошибки, определяли вероятность достоверности различий между сравниваемыми средними величинами, используя непараметрический критерий Манна–Уитни. Различия между сравниваемыми средними величинами являлись достоверными при p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение. В культурах перитонеальных клеток контрольной группы отмечалась достаточно низкая частота встречаемости бинуклеарных и в особенности одноядерных макрофагов с цитоморфологическими признаками клеточного слияния, причем многоядерные макрофаги практически не участвовали в реакциях клеточной фузии (табл.), чем, по мнению автора, может быть объяснено низкое относительное содержание в интактных культурах перитонеальных клеток бинуклеарных и многоядерных макрофагов (3,3+0,3 %).
Относительная численность макрофагов (%) в культурах перитонеальных клеток мышей с признаками мультинуклеации и экспрессии TNF-α, IFN-γ, Integrin-β1, Integrin-β2
|
Показатель |
Интактные мыши |
БЦЖ-инфицированные мыши |
||||
|
Количество ядер в макрофагах |
Количество ядер в макрофагах |
|||||
|
1 |
2 |
3 и более |
1 |
2 |
3 и более |
|
|
Амитоз |
1,0+0,1 |
3,0+0,2♦ |
6,6+1,0♦ |
2,8+0,2* |
6,0+0,5*♦ |
9,0+2,0♦ |
|
Фузия |
0,3+0,1 |
2,0+0,2♦ |
0♦ |
4,8+0,8* |
12,0+1,0*♦ |
14,6+1,5*♦ |
|
TNF-α |
1,5+0,2 |
0♦ |
0♦ |
11,0+1,3* |
32,0+3,2*♦ |
23,0+2,0*♦ |
|
IFN-γ |
11,0+1,0 |
21,9+2,0♦ |
63,5+4,5♦ |
84,0+3,0* |
83,0+6,6* |
78,3+3,5* |
|
Integrin-β1 |
12,8+2,0 |
47,0+4,4♦ |
29,0+2,9♦ |
79,5+6,0* |
73,3+3,0* |
92,0+8,0* |
|
Integrin-β2 |
1,0+0,2 |
1,5+0,2 |
0♦ |
45,0+3,0* |
70,0+5,7*♦ |
75,0+7,5*♦ |
Примечание: группы включали одинаковое количество (n) образцов культур клеток (n = 6); *p<0,05 по сравнению с контролем при межгрупповом сравнении; ♦p<0,05 по сравнению с одноядерными макрофагами при сопоставлении данных в пределах одной группы культур.
В то же время присутствующие в интактных клеточных культурах многоядерные макрофаги, по-видимому, формировались преимущественно не вследствие клеточного слияния, но в результате амитотического деления ядер. Данный процесс клеточной мультинуклеации, имеющий большое значение в образовании многоядерных макрофагов в интактных культурах перитонеальных клеток [5], был основным механизмом формирования не только собственно многоядерных, но и бинуклеарных макрофагов (табл.).
Говоря о продукции макрофагами цитокинов, контролирующих процесс клеточного слияния, следует заметить, что, например, экспрессия TNF-a, являющегося индуктором фузии макрофагов, была отмечена только у весьма незначительного количества мононуклеарных макрофагов, тогда как у двуядерных и полинуклеарных макрофагальных производных таковая практически отсутствовала (табл.). В то же время продукция такого цитокина, как IFN-g, наблюдалась у макрофагов, принадлежащих к различным классам ядерности (табл.). При этом максимальный уровень экспрессии IFN-g был зарегистрирован у многоядерных макрофагов (табл.). Некоторая роль в индукции клеточного слияния принадлежала бинуклеарным и одноядерным макрофагам, присутствовавшим в интактных культурах, но значимо уступавшим полинуклеарам по интенсивности продукции IFN-g (табл.).
У макрофагов наблюдалась экспрессия интегринов-β1 и -β2, непосредственно участвующих в обеспечении процесса клеточного слияния. Причем максимальный уровень экспрессии интегрина-β1 был зарегистрирован у бинуклеарных макрофагов (табл.). Тем не менее, экспрессия интегрина-β2 наблюдалась лишь у незначительного количества моно- и бинуклеарных макрофагов и практически отсутствовала у многоядерных макрофагальных производных (табл.).
В культурах перитонеальных клеток экспериментальной группы отмечался значительно иной характер реализации процессов мультинуклеации макрофагов, что было определено на основе учета цитоморфологических признаков наличия амитотического деления ядер, клеточного слияния, экспрессии у макрофагов изученных типов цитокинов и интегринов. Прежде всего, обращает на себя внимание существенно большая частота встречаемости бинуклеарных и особенно многоядерных макрофагов с признаками межклеточной фузии по сравнению с аналогичным показателем у мононуклеаров (табл.), что детерминировало увеличение численности би- и полинуклеарных макрофагов до 11,5+0,4% (*p<0,05). Однако в макрофагальной мультинуклеации определенное значение имело и амитотическое деление ядер этих клеток (табл.).
Продукция индуцирующего процесс клеточного слияния TNF-a наблюдалась у макрофагов, принадлежащих к различным классам ядерности, но максимальный уровень продукции этого медиатора был зарегистрирован у бинуклеарных макрофагов, которым по данному показателю уступали полинуклеары и в значительно большей степени – одноядерные макрофаги (табл.). Однако независимо от принадлежности макрофагов к конкретному классу ядерности у них наблюдали исключительно высокий уровень продукции IFN-g (табл.). Аналогичное утверждение было вполне справедливо в отношении характера экспрессии у макрофагов интегрина-β1 (табл.). Однако уровень экспрессии у мононуклеарных макрофагов интегрина-β2 уступал таковому у интегрина-β1 в культурах перитонеальных клеток экспериментальной группы (табл.).
Далее следует провести сравнительный анализ особенностей реализации обусловливающего мультинуклеацию макрофагов процесса их слияния. Несомненно, что наблюдаемое в культурах перитонеальных клеток экспериментальной группы весьма существенное возрастание частоты встречаемости двуядерных и полинуклеарных макрофагов было обусловлено активизацией процесса клеточной фузии. На это непосредственно указывало в исключительной степени выраженное увеличение количества макрофагов, принадлежащих ко всем учитываемым классам ядерности, с признаками клеточного слияния в культурах экспериментальной группы по сравнению с контрольным уровнем названного показателя (табл.). Данная тенденция была наиболее характерна для многоядерных и в несколько меньшей степени – для бинуклеарных макрофагов (табл.).
В отношении учета иммуноцитохимических признаков продукции медиаторов и экспрессии молекул клеточной поверхности, детерминирующих процесс фузии макрофагов, можно заметить следующее. По сравнению с соответствующими контрольными показателями уровень экспрессии TNF-a, IFN-g, а также интегринов-β1 и -β2 у разнящихся по классам ядерности макрофагов, присутствовавших в культурах перитонеальных клеток экспериментальной группы, в целом характеризовался как весьма высокий (табл.).
По сравнению с мононуклеарами бинуклеарные и многоядерные макрофаги в культурах экспериментальной группы имели высокую степень экспрессии TNF-a, практически отсутствующую у двуядерных и полинуклеарных клеток в интактных культурах (табл.). По показателю численности моно- и бинуклеарные макрофаги в культурах клеток экспериментальной группы многократно превосходили экспрессирующие IFN-g макрофаги с соответствующими классами ядерности в интактных культурах (табл.).
Межгрупповые различия в отношении частоты встречаемости макрофагов, экспрессирующих интегрины-β1 и -β2, состояли в том, что моно- и полинуклеары, а также би- и полинуклеары приобретали наибольшую интенсивность экспрессии соответственно интегринов-β1 и -β2 (табл.). Причем по сравнению с исходным уровнем экспрессии интегринов-β2 макрофаги, имеющие признаки таковой, превосходили клетки с экспрессией интегринов-β1 (табл.). Небезынтересно отметить, что в ряде случаев наблюдалась выраженная экспрессия интегринов-β1 и -β2 на границе слияния макрофагов, которой предшествовала взаимная адгезия этих клеток друг к другу.
Таким образом, вследствие высокой интенсивности реализации процессов мультинуклеации макрофагов, детерминированных клеточным слиянием, в культурах перитонеальных клеток, выделенных от БЦЖ-инфицированных животных, наблюдали существенное возрастание численности би- и полинуклеарных макрофагов по сравнению с контрольным уровнем. Высокая степень продукции макрофагами цитокинов TNF-a и IFN-g, контролирующих процессы клеточного слияния, и экспрессии у этих клеток интегринов-β1 и -β2, непосредственно участвующих в фузии макрофагов, обусловливала характер наблюдаемых реакций мультинуклеации макрофагов в культурах экспериментальной группы. По сравнению с мононуклеарными макрофагами отличительной особенностью бинуклеарных и многоядерных макрофагов являлась высокая степень экспрессии у них IFN-g и интегринов-β1 в интактных клеточных культурах, тогда как в культурах, выделенных от БЦЖ-инфицированных животных, двуядерные и полинуклеарные макрофаги наиболее интенсивно экспрессировали TNF-a и интегрины-β2.
Кроме того, учитывая наличие феномена M1/M2-поляризации макрофагов, следует отметить, что требуется оценка роли цитокинов и CD рецепторов, экспрессия которых указывает на характер макрофагальной дифференцировки в соответствующем направлении поляризации [10-12]. Это целесообразно принимать во внимание при исследовании процессов мультинуклеации клеток гистиоцитарного генеза, поскольку цитокины и молекулы клеточной поверхности обеспечивают такой механизм полинуклеации макрофагов, как их слияние [5].
В этом отношении перспективным представляется совместный учет комплекса соответствующих регуляторных и структурных белков, участвующих в обоих процессах (поляризации и мультинуклеации макрофагов), что объясняется возможным наличием между ними патогенетической взаимосвязи, обусловливающей формирование и дифференцировку многоядерных макрофагальных производных, участвующих в гранулемогенезе – патогенетической основе туберкулезного гранулематоза.
Заключение. Подводя общий итог обсуждения рассматриваемых в данной статье аспектов, следует заметить, что изучение у разнящихся по классам ядерности макрофагов характера продукции медиаторов и экспрессии молекул клеточной поверхности, участвующих в реализации механизмов мультинуклеации этих клеток, вовлеченных в осуществление гранулемогенеза, лежащего в основе развития широкого ряда распространенных инфекционных гранулематозов, включая туберкулезный гранулематоз, необходимо для более ясного понимания особенностей его патогенеза.
Высокий функциональный потенциал многоядерных макрофагов, неоднократно превосходящих в этом отношении мононуклеарные формы и играющих регуляторную роль в реализации гранулемогенеза и в развитии фиброзных осложнений туберкулезного гранулематоза, требуется учитывать при разработке перспективных методов цитологической диагностики этого заболевания, поскольку многоядерные макрофаги являются клетками-маркерами туберкулезного гранулематоза, что следует принимать во внимание при прогнозировании его развития и при контроле эффективности проводимой терапии.