Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Перинатальное гипоксически-ишемическое поражение центральной нервной системы развивается в результате дефекта кровотока, недостаточного поступления О2 к мозгу плода или новорожденного и относится к ведущим причинам серьезного неврологического дефицита у детей [1; 2, с. 17]. Повреждение головного мозга у новорожденных имеет этапный характер и включает эксайтотоксичность, разрушение митохондрий, окислительный стресс и воспаление, приводящее к прогрессирующей гибели нейронов [1]. Разрушение тканей приводит к активации инфламмасомы в клетках ЦНС, образованию провоспалительных интерлейкинов, главным образом IL1β и ТNFα, способствующих стойкому воспалению и развитию деструктивных процессов [3]. Полиморфизмы генов воспалительных цитокинов могут модифицировать их экспрессию, влияя на фактор транскрипции или микроРНК [3]. Генетически детерминированное увеличение провоспалительных медиаторов способствует апоптозу олигодендроцитов, дегенерации нейронов и формированию неблагоприятных неврологических исходов [4, 5].

Цель исследования: определение прогностической значимости полиморфных биомаркеров при гипоксически-ишемической энцефалопатии (ГИЭ) у новорожденных.

Материал и методы исследования. Обследованы 96 младенцев русской национальности, проживающих на Юге России, с ГИЭ 2-й (70 детей) и 3-й степени (26 детей), имевших сроки гестации более 37 недель и массу более 2000 г, на базе ГБУЗ СК «Ставропольский краевой клинический перинатальный центр № 1». Исследование одобрено локальным этическим комитетом Ставропольского государственного медицинского университета. Родители новорожденных подписывали информированное согласие на участие в исследовании.

Выполнены анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SPN) IL1β (-31) С>Т (rs1143627) и определение IL1β в сыворотке крови у новорожденных. При верификации диагноза принимали во внимание наличие у новорожденного трех и более признаков гипоксического поражения ЦНС, таких как нарушение сердечного ритма, окрашенные меконием околоплодные воды, проведение искусственной вентиляции легких в течение 5 минут и более, нарушение кислотно-основного обмена (pH<7,1 и/или BE<-16), а также клинические признаки энцефалопатии или органной дисфункции [6, с. 18]. В исследование не включали новорожденных с пороками развития, внцтриутробными инфекциями, врожденной пневмонией, некротизирующим энтероколитом, неоанатальным сепсисом, внутричерепными кровоизлияниями. В контрольную группу вошли 30 доношенных детей без перинатальной патологии, имевших оценку по шкале Апгар при рождении 9–10 баллов. Дети наблюдались неврологом и педиатром детских поликлиник, а также на базе психоневрологического отделения ГБУЗ СК «Краевая детская клиническая больница» с периодичностью 1 раз в 2–3 месяца. Оценку резидуальных исходов гипоксически-ишемической энцефалопатии осуществляли в возрасте 18 месяцев. Уровень моторного развития определяли с помощю коэффициента Motor quotient (MQ), интеллектуального – Developmental quotient (DQ) [7, с. 451]. Из 96 детей, включенных в исследование, неврологические исходы удалось оценить у 67 детей. Умерших детей было 5, потерянных для наблюдения – 24. У выживших детей констатировали благоприятный (БИ) и неблагоприятный исходы (НИ). Исход считали неблагоприятным в случае гибели ребенка и при формировании неврологического дефицита: детского церебрального паралича (ДЦП), структурной эпилепсии, гидроцефалии, нарушении слуха и зрения, а также задержке психомоторного развития (DQ<75% и/или MQ<70%).

Определение IL1β в сыворотке крови выполняли методом ИФА с помощью коммерческих тест-систем «Вектор-Бест». Образцы крови у новорожденных собирали в течение 4–72 часов после рождения, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, отделяли сыворотку крови, хранили в эппендорфах при – 20°С.

Исследование полиморфизма IL1β (-31) С>Т (rs1143627) проводили на базе ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора». Выделение геномной ДНК осуществляли с помощью реагентов «ДНК-экспресс-кровь» и наборов «Quant-iT dsDNA asay kit». Генотипирование SNP – IL1β (-31) С>Т выполняли методом RFLP analysis (Restriction Fragment Length Polymorphism) с применением амплификатора «Терцик» (ООО «ДНК-Технология», Россия) и диагностических тест-систем «SNP-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г. Москва). Для разделения продуктов амплификации использовали метод горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле, с электрофоретической детекцией («BioRad Laboratories», США).

Статистические методы. Анализ полученных данных осуществляли с помощью программ «Attestat 10.5.1.», «Statistica SPSS». При непараметрическом распределении результаты представляли в виде медианы и интерквантильного (25-й и 75-й процентили) размаха (Me (Q1-Q)). Для оценки различий количественных показателей применяли критерий Манна–Уитни. Статистическую значимость различий в частотах аллельных вариантов и генотипов определяли с помощью критерия χ2 Пирсона. Степень риска развития событий оценивали по величине отношения шансов (OR) с расчетом доверительного интервала CI. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

При определении диагностической значимости признаков применяли анализ ROC-кривых с оценкой чувствительности, специфичности, положительной и отрицательной предсказательной ценности.

Результаты исследования и их обсуждение. У новорожденных с тяжелой и среднетяжелой формами гипоксической энцефалопатии определялись низкие показатели по шкале Апгар, брадикардия, симптомы угнетения, судороги, нарушение показателей кислотно-основного состояния (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика новорожденных детей с гипоксически-ишемической энцефалопатией

Примечание: * – достоверность различий по сравнению с контрольной группой, p<0,05 (критерий χ2 Пирсона).

Катамнестическое наблюдение осуществлено у 67 детей. Неблагоприятные неврологические исходы сформировались у 33 (49,3%) детей в виде структурной эпилепсии (14,9%), ДЦП (17,9%), гидроцефалии (11,9%), нарушений зрения (2,9%), слуха (5,9%), задержки психомоторного развития (50,7%). Выявлено увеличение IL1β у новорожденных с ГИЭ 2-й степени – 13,2 (7,3–18,2) пг/мл, p=0,001, и ГИЭ 3-й степени – 20,8 (14,4–28,9) пг/мл, p=0,003, по сравнению со здоровыми детьми – 5,15 [3,50; 6,50] пкг/мл. Максимальные показатели IL1β определялись у младенцев с тяжелой степенью гипоксически-ишемического поражения ЦНС, p=0,02. Отмечено, что дети с неблагоприятными резидуальными последствиями и неврологическим дефицитом имели более высокие показатели IL1β при рождении – 22,70 (16,8–28,1) пг/мл – по сравнению с младенцами с благоприятными исходами – 7,30 [5,2; 12,75] пг/мл (p= 0,04) и контрольной группой – 5,15 [3,50; 6,50] пг/мл (p= 0,003). Повышение риска неблагоприятных неврологических исходов установлено при уровне IL1β >16,8 пг/мл (OR=29,0; 95% CI: 7,24–116,4) с высокой чувствительностью (74%), специфичностью (91%), положительной (91%) и отрицательной (75%) предсказательной ценностью.

При определении полиморфизма гена IL1β (-31) C>Т (rs1143627) выявлено, что у новорожденных с ГИЭ более распространенным, чем в контрольной группе, был редкий аллель – IL1β -31Т (62% и 46,7%, p=0,04), показатели отношения шансов у обладателей которого составили 1,86 (95% CI: 1,03–3,34) (табл. 2). Чаще встречался и гомозиготный генотип по редкому аллелю – -31Т/Т c увеличением риска развития заболевания до 2,86 (95% CI: 1,07–7,63). Встречаемость гетерозиготного генотипа – -31С/Т в группах ГИЭ и у здоровых детей была сопоставимой – 40,6% и 53,3%. Высокий риск развития ГИЭ был установлен у новорожденных с генотипами высокой экспрессии IL1β – ТТ+СТ (OR=3,09; 95% CI: 1,26–7,61; p=0,01).

Таблица 2

Распространенность аллелей и генотипов IL1β (rs1143627) у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС

Примечание: p – статистическая значимость различий по сравнению с группой сравнения (критерий χ2 Пирсона) OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

При определении полиморфизма гена IL1β (-31)С/Т в зависимости от степени тяжести гипоксически-ишемической энцефалопатии установлено увеличение риска развития заболевания у обладателей редкого аллеля -31Т как для ГИЭ 2-й степени (OR=1,71; 95% CI 0,93–3,15; p=0,0049), так и для ГИЭ 3-й степени (OR=2,35; 95% CI 1,09–5,08; p=0,03) (табл. 3). У младенцев обеих групп отмечена высокая распространенность гомозигот по редкому аллелю – -31Т/Т (OR=2,67; 95% СI 0,07–7,35; p=0,049 и ОR=3,43; 95% CI 1,05–11,17; p=0,037 соответственно). При этом распространенность редкого аллеля (-31)Т и гомозиготного по редкому аллелю генотипа – (-31)Т/Т не зависела от степени тяжести гипоксического поражения ЦНС.

Таблица 3

Распространенность аллелей и генотипов IL1β (rs1143627) у детей с гипоксически-ишемической энцефалопатией в зависимости от степени тяжести ГИЭ

Примечание: ГИЭ – гипоксически-ишемическая энцефалопатия, КГ – контрольная группа, n – число детей, p – значимость различий между группами новорожденных (критерий χ2 Пирсона), OR – отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал

Неблагоприятные резидуальные исходы чаще реализовались у резидентов аллелей IL1β (-31)Т (ОR=2,52; CI: 0,97–6,53, p=0,049) и генотипов IL1β (-31)Т/Т (ОR=1,99; CI: 0,99–3,99, p=0,049) (табл. 4).

Таблица 4

Распространенность аллелей и генотипов IL1β (rs1143627) у новорожденных с гипоксически-ишемическим поражением ЦНС в зависимости от исхода

Примечание: p – значимость различий между группами (критерий χ2), OR отношение шансов, CI – 95%-ный доверительный интервал.

Максимальная продукция IL1β определялась у респондентов аллеля -31Т и генотипов -31Т/Т+-31С/Т (16,1 [9,90; 21,70] пкг/мл), статистически значимые различия отмечены по сравнению с обладателями -31С/С – 16,1 [9,90; 21,70] пкг/мл, p=0,02.

IL1β является важнейшим медиатором провоспалительных реакций, способствует экспрессии молекул адгезии, хемотаксису иммунокомпетентных клеток, симулирует продукцию других противовоспалительных цитокинов, что приводит к нарушению гематоэнцефалического барьера и повреждению нейронов [3]. Ранее установлена диагностическая и прогностическая ценность IL1β у младенцев с гипоксически-ишемической энцефалопатией [3, 8, 9]. Высокие значения IL1β в периоде новорожденности ассоциированы с серьезными неврологическими последствиями – формированием структурной эпилепсии, ДЦП, гидроцефалии, дефицитом интеллектуального развития [10, 11, 12], что согласуется с результатами исследования и подтверждает его ведущее значение в пролонгированном повреждении нейронов в латентной фазе гипоксически-ишемической травмы.

В соответствии с существующими литературными данными, полиморфизм гена IL1β (rs1143627) модифицирует связывание транскрипционных факторов, при этом вариантный аллель IL1β (-31)/Т ассоциирован с повышенной продукцией IL1β в сравнении с аллелем дикого типа IL1β (-31)/С [13]. Полученные результаты позволяют предположить, что высокая экспрессия IL1β приводит к серьезному повреждению нейронов и формированию неблагоприятных неврологических последствий.

Таким образом, у новорожденных с гипоксически-ишемической энцефалопатией средней и тяжелой степени отмечается увеличение экспрессии IL1β, коррелирующее со степенью тяжести ГИЭ. Высокие уровни IL1β >16,8 пг/мл в первые 42 часа после рождения могут быть использованы в качестве биологического маркера неблагоприятных неврологических исходов (OR=29,0; 95% CI: 7,24–116,4). Факторами риска ГИЭ и формирования резидуальных последствий являются аллель IL1β (-31)Т и генотип IL1β (-31)Т/Т. Высокая продукция IL1β ассоциирована с аллелем IL1β (-31)Т. Индивидуальные генетические различия новорожденных, определяющие экспрессию IL1β, могут быть вовлечены в патоморфологию гипоксического поражения мозга и должны учитываться в терапии и профилактике прогрессирующего поражения ЦНС.