Протеолиз является одним из универсальных процессов, протекающих в живой природе, на котором в значительной степени базируется поддержание здоровья организма. Протеолитические ферменты вносят свой вклад в процессы управляемого биосинтеза, созревания, функционирования и терминального распада белков, необратимо расщепляя пептидные связи. Для выполнения множества селективных и хорошо контролируемых протеолитических функций человеческий геном кодирует более 550 протеаз и более 200 эндогенных ингибиторов протеаз [4]. В системе лизосом деградацию белка осуществляют примерно 50 известных гидролаз, среди которых наиболее изученными являются лизосомальные цистеиновые пептидазы (ЛЦП).

ЛЦП относят к клану СА семейства С1. Семейство C1 - папаиноподобные ферменты - проявляет свою протеолитическую активность в пищеварительных вакуолях простейших и лизосомальных системах эукариотических клеток. Наиболее изученными представителями являются катепсин В (C01.060), катепсин L (C01.032), катепсин S (C01.034), катепсин К (C01.036), катепсин H (C01.040) и дипептидил-пептидазы (C01.070) [11].

Первоначально считалось, что ЛЦП выполняют в клетке функции неспецифического протеолиза, но в течение последних двух с половиной десятилетий получено много данных об их участии в выполнении специфических функций при различных физиологических и патологических процессах [14].

В результате многочисленных исследований было установлено, что цистеиновые протеиназы принимают участие в развитии таких заболеваний, как аневризма абдоминальной аорты [13], рак и неоваскуляризация [6], сердечно-сосудистые заболевания [12]. Участие катепсинов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний обусловлено их действием на элементы соединительной ткани. Так, катепсины В и в большей степени L могут повреждать коллаген II, IX и XI типов в кислых значениях рН, оказывать эластолитическое, коллагенолитическое и протеогликанолитическое действие [8].

На сегодняшний день распространёнными патологиями венозной системы человека являются варикозная болезнь нижних конечностей (ВБНК) и острый венозный тромбоз. Обе они представляют серьёзную проблему современного здравоохранения, так как в конечном итоге тромбоз может привести к формированию посттромбофлебитической болезни [5], обе патологии снижают трудоспособность и качество жизни пациентов, и зачастую приводят к инвалидизации и смертности.

Но данные об участии ЛЦП в патологии венозной системы остаются немногочисленными. В настоящее время появились работы, посвящённые участию лизосомальных ферментов нейтрофилов в появлении и прогрессировании трофических язв на фоне хронической венозной недостаточности [10]. Немаловажная роль отводится так называемым «активированным» лейкоцитам и макрофагам, которые могут явиться основным фактором повреждения венозной стенки и клапанов, а также паравазальных тканей при первичных формах хронических заболеваний вен нижних конечностей [1].

Поэтому актуальным остаётся дальнейшее изучение молекулярных механизмов патогенеза данных заболеваний.

Цель исследования - изучение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ - катепсинов L и Н в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей.

Материал и методы исследования

Объектом исследования явились 65 пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, в том числе 40 пациентов с диагнозом «острый венозный тромбоз» и 25 пациентов с диагнозом «варикозное расширение вен нижних конечностей», находившихся на стационарном лечении в отделении сосудистой хирургии ГБУ РО «Областной клинический кардиологический диспансер» г. Рязани в 2011-2013 гг.

Средний возраст пациентов с острым венозным тромбозом и варикозным расширением вен нижних конечностей составил 62,5±11,7 и 47,6±13,7 года соответственно. Группу контроля составили клинически здоровые доноры отделения переливания крови ГУЗ «Рязанская областная клиническая больница), сопоставимые с испытуемыми по возрасту и полу.

Материалом для исследования явились плазма и лейкоциты периферической крови. Забор крови у пациентов производился утром в одно и то же время из локтевой вены натощак в количестве 15 мл. В качестве антикоагулянта использовали 0,5 М раствор ЭДТА.

Для выделения различных фракций лейкоцитов эритроциты осаждали 6 % раствором декстрана, после чего плазму со взвешенными в ней лейкоцитами подвергали изопикническому центрифугированию на градиенте плотности урографин - полиглюкин. При этом получали две фракции лейкоцитов: интерфазный слой содержал моноядерные лейкоциты (МЯЛ), представленные лимфоцитами и моноцитами, осадок - полиморфноядерные (ПМЯЛ) гранулоциты. Клетки отмывали 0,15 М раствором хлорида натрия, пропускали через капроновый фильтр, подсчитывали в камере Горяева и гомогенизировали пипетированием через иглу малого диаметра. Чистоту разделения лейкоцитов проверяли микроскопией окрашенных мазков из интерфазы и осадка (микроскоп бинокулярный Р-15 «Биолам»). Полученные описанным выше способом осадки отмытых лейкоцитов доводили до концентрации 10⁶ - 10⁷ клеток/мл дистиллированной водой, содержащей 0,1% раствор тритона Х - 100 и подвергали трёхкратному замораживанию - оттаиванию для окончательного разрушения плазматических и лизосомальных мембран. Гомогенизация производилась пипетированием через иглу малого диаметра. Нерастворимый материал осаждался центрифугированием (600 g, 10 минут). Супернатант использовался для определения активности ферментов.

Активность катепсинов L и Н изучали спектрофлуориметрическим методом по Barrett и Kirschke [3] с измерением флюоресцирующего продукта реакции - 7-амидо-4-метилкумарина, образующегося при расщеплении специфических флюорогенных субстратов. Результаты представляли в нмоль/чхл и в нмоль/10⁶ клеток.

Оценка аутоаталитической активации проводилась путём преинкубирования биологического материала в реакционной смеси, не содержащей субстрат, в течение 15 минут при 37ºС с последующим добавлением последнего [2]. Для сравнения степени аутокаталитической активации катепсинов подсчитывали коэффициент аутокаталитической активации (КАА): отношение значения активности ферментов после прекаталитической инкубации к значению активности, определённому без преинкубации.

Содержание цистатина С проводили с использованием наборов иммуноферментного анализа (ИФА) для определения цистатина С (ЦС) человека Bio Vendor (Чехия), содержащих специфичные для цистатина С человека антитела. Результаты представляли в нг/мл и нг/10⁶ клеток.

Для оценки статистической значимости межгрупповых различий использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении активности катепсинов L и Н в сыворотке и лейкоцитах крови у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей были выявлены следующие тенденции (табл.1).

Таблица 1

Показатели активности катепсинов L и Н в плазме (нмоль/чхл) и лейкоцитах (нмоль/чх10⁶ клеток) крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, M±s

		Контрольная группа	Группа 1 (пациенты с варикозным расширением вен)	Группа 2 (пациенты с острым венозным тромбозом)
		n=25	n=25	n=40
ПЛАЗМА	Активность катепсина L	4,19 ± 2,33	9,18 ± 5,9*	5,79 ± 2,35*
	Активность катепсина Н	3,87 ± 3,17	9,44 ± 8,76*	4,44 ±2,56*
ПМЯЛ	Активность катепсина L	13,07 ± 5,29	20,28 ± 10,17*	13,74 ± 9,96
	Активность катепсина Н	3,65 ± 1,64	9,12 ± 5,27*	4,96 ± 3,90**
МЯЛ	Активность катепсина L	34,42 ± 14,70	16,42 ± 9,26*	32,46 ± 25,67**
	Активность катепсина Н	25,09 ± 14,44	9,09 ± 8,89*	13,92 ± 12,60*
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05), ** - статистически значимые отличия от группы 1 (р<0,05).

Активность катепсинов L и Н статистически значимо повышается в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах крови у пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей по сравнению с аналогичными показателями здоровых доноров. Активность же изучаемых ферментов в моноядерных лейкоцитах имеет противоположную тенденцию - статистически значимо снижается у пациентов с варикозом по сравнению с группой контроля.

У пациентов с острым венозным тромбозом активность исследуемых катепсинов статистически значимо повышается в плазме крови, статистически незначимо повышается в ПМЯЛ, а также снижается в МЯЛ (статистически значимо - активность катепсина Н, статистически незначимо - активность катепсина L).

Полученные данные позволяют предположить вовлечённость лизосомальных ферментов лейкоцитов в патологию вен нижних конечностей, что согласуется с данными литературы об участии лейкоцитов в данной патологии.

Из представленных данных видно, что изменение активности катепсинов L и Н у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей имеет однонаправленную тенденцию: повышается активность катепсинов L и Н в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах, снижается в моноядерных лейкоцитах. Степень изменения активности в плазме и лейкоцитах крови выше у пациентов с варикозным расширением вен.

При изучении содержания цистатина С в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей мы обнаружили следующее (табл. 2).

Таблица 2

Содержание цистатина С в плазме (нг/мл) и лейкоцитах крови (нг/10⁶) пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, M±s

	Контрольная группа	Группа 1 (пациенты с варикозным расширением вен)	Группа 2 (пациенты с острым венозным тромбозом)
Плазма	1017,8 ± 114,30	636,31 ± 406,08	3600,38 ± 763,83*,**
ПМЯЛ	147,12 ± 91,99	139,38 ± 97,58	184,4 ± 109,62
МЯЛ	822,78 ± 213,56	305,44 ± 111,97*	492,67 ± 256,08*,**
Примечание: * - статистически значимые отличия (р<0,05), ** - статистически значимые отличия от группы 1 (р<0,05).

Концентрация цистатина С в плазме крови здоровых доноров оказалась сопоставима с данными литературы [7]. Из представленных данных видно, что концентрация эндогенного ингибитора ЛЦП цистатина С снижается в плазме, ПМЯЛ и МЯЛ крови пациентов с варикозным расширеним вен нижних конечностей. Причём снижение в МЯЛ является статистически значимым. Концентрация цистатина С повышается в плазме и ПМЯЛ крови, снижается в МЯЛ пациентов с острым венозным тромбозом. Необходимо отметить, что при более значительном повышении активности катепсинов (в 1,5-3 раза), что отмечалось в плазме и ПМЯЛ крови пациентов с варикозом, концентрация цистатина С снижалась. При незначительном повышении активности катепсинов (до 1,5 раз), что мы наблюдали в плазме и ПМЯЛ пациентов с острым венозным тромбозом, концентрация цистатина С повышалась, что позволяет подтвердить участие цистатина С как фактора регуляции активности изучаемых катепсинов при заболеваниях вен нижних конечностей. В моноядерных лейкоцитах крови как при варикозном расширении вен нижних конечностей, так и при остром венозном тромбозе отмечалась однонаправленная тенденция - снижение активности изучаемых катепсинов и концентрации их эндогенного ингибитора цистатина С.

Полученные данные согласуются с данными литературы о вовлечении лизосомального фермента L и его эндогенного ингибитора цистатина С в патогенез варикозной болезни нижних конечностей (ВБНК) [15].

При изучении аутокаталитического процессинга в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей были отмечены следующие тенденции (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ изменения коэффициента аутокаталитической активации в плазме и лейкоцитах крови пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей, M±s

	Контрольная группа			Группа 1 (пациенты с варикозным расширением вен)		Группа 2 (пациенты с острым венозным тромбозом)
	Катепсин L	Катепсин Н		Катепсин L	Катепсин Н	Катепсин L	Катепсин Н
Плазма	1,18 ± 0,55		0,9 ± 0,40	0,78± 0,34*	0,69 ± 0,25*	1,03 ± 0,32	1,17 ± 0,54*,**
ПМЯЛ	1,01 ± 0,15		0,99 ± 0,08	0,96 ± 0,14	0,79± 0,19*	1,12 ± 0,18	1,01 ± 0,17**
МЯЛ	1,04 ± 0,12		0,78 ± 0,13	0,93± 0,10*	0,67 ± 0,22	1,18 ± 0,47**	1,04 ± 0,13*,**
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05), ** - статистически значимые отличия от группы 1 (р<0,05).

У пациентов с варикозным расширением вен нижних конечностей катепсины L и Н находятся в активированном состоянии, степень аутокаталитической активации меньше как для катепсина L, так и для катепсина Н в плазме, ПМЯЛ, МЯЛ крови.

Острый венозный тромбоз сопровождается активацией незрелых форм катепсинов: катепсина L плазмы, ПМЯЛ, МЯЛ и катепсина Н плазмы и МЯЛ крови. Причём наибольшие изменения активности после аутокатализа отмечаются для катепсина Н в моноядерных лейкоцитах при тромбозе и для катепсина L в плазме при варикозе. Возможно, такие различия в аутокаталитическом процессинге связаны с хроническим течением при варикозе, что сопровождается полной активацией изучаемых ферментов.

Выводы

1. Изменение активности катепсинов L и Н у пациентов с заболеваниями вен нижних конечностей имеет однонаправленную тенденцию: повышается активность катепсинов L и Н в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах, снижается в моноядерных лейкоцитах. Степень изменения активности в плазме и лейкоцитах крови выше у пациентов с варикозным расширением вен.
2. Концентрация цистатина С снижается в плазме, полиморфноядерных и моноядерных лейкоцитах крови пациентов с варикозным расширением вен. Концентрация цистатина С повышается в плазме и полиморфноядерных лейкоцитах крови и снижается в моноядерных лейкоцитах пациентов с острым венозным тромбозом.
3. Изменения КАА позволяют предположить, что при остром венозном тромбозе в плазме и лейкоцитах крови катепсины L и Н не полностью активированы, при варикозном расширении вен наблюдается их полная активация.

Демихов В.Г., д.м.н., профессор, директор Рязанского филиала ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачёва», г. Рязань;

Емельянова А.С., д.б.н., профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства, ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева», г. Рязань.