Из года в год растет интерес к фототерапии при профилактике и лечении ряда заболеваний. Наиболее часто в фототерапии применяют низкоинтенсивное излучение лазеров и светодиодных ламп [3, 6]. Альтернативой является источник белого света, излучение которого модулируется с помощью светофильтров [7]. Предлагаемый нами подход основан на использовании преобразованного солнечного света (ПСС), получаемого при помощи светофильтров с включением полупроводниковых нанокристаллов или квантовых точек (КТ), преобразующих УФ-компоненту солнечного спектра в свет оранжево-красного диапазона (λmax=626 нм). В литературе имеются лишь единичные упоминания об использовании преобразованного таким образом солнечного света для биомодуляции функций животных организмов, в частности при фотостимуляции репаративных процессов [5]. Целью данной работы было исследовать влияние оранжево-красной компоненты (λmax=626 нм) в спектре преобразованного модельного солнечного света на жизнеспособность клеток млекопитающих в условиях in vitro.

Материал и методы исследования

В качестве фотолюминофоров были взяты полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы CdSe/CdS (квантовые точки, КТ) размером 5-7 нм (НТИЦ «Нанотех-Дубна»). Спектры возбуждения и эмиссии КТ получали на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian, США). Энергетическая освещённость световых потоков измерялась пиранометром CMP-3 (Kipp & Zonen, Нидеpланды). Облучение клеток с помощью лабораторного осветителя ЛОС-1 (Россия) с ксеноновой лампой OSRAM XBO150 (мощность 150 Вт), излучение которой в видимом диапазоне и в УФ- диапазоне спектра близко к спектру излучения Солнца, падающего на поверхность Земли (группа СС). Светопреобразующие экраны были изготовлены из пластин полиметилфенилсилоксана (ПФМС) толщиной 0,5 мм, с включением 0,1% квантовых точек CdSe/CdS, получаемый при этом световой поток называли преобразованным солнечным светом (группа ПСС). В качестве контроля использовали такие же пластины ПМФС без включения квантовых точек, которые поглощали свет, в том числе в УФ-диапазоне в той же мере, как и светопреобразующие экраны  (группа CC-УФ). Расчетные данные по дозам облучения при использовании различных режимов облучения приведены в таблице 1. Нагрев среды культивирования во время проведения эксперимента не превышал 0,1ºC.

Таблица 1. Расчет  экспозиционной дозы облучения при различных режимах.

Исследование in vitro проводили с использованием фибробластов линии 3Т3 clone NIH и эпителиальных клеток линии HEp-2 из коллекции клеточных культур Института Биофизики Клетки РАН, а также клеток роговицы глаза кролика линии SIRC (Коллекция культур клеток позвоночных). Клетки линии HEp-2 и SIRC культивировали в среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС; FBS HyClone) и 100 Ед/мл пенициллин/стрептомицина в атмосфере 5% СO2. Фибробласты культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС. Клетки высевали на поверхность 96-луночных планшетов с плотностью 20 тыс.кл/см2 и через 12 часов проводили облучение.  Число параллельных экспериментов составляло не менее трех.

Определение жизнеспособности клеток проводили через сутки после облучения на микроскопе Axiovert 200 (Карл Цейс, Германия) с использованием окрашивания клеток набором L-7007 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen), в который  входят два флуоресцентных красителя: SYTO 9 и иодид пропидия.  Исследование метаболической активности клеток проводили с использованием МТТ-теста по методике, опубликованной ранее [1]. Обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента, статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты исследования

Спектры возбуждения и эмиссии растворов квантовых точек измеряли в диапазоне длин волн от 300 до 800 нм (Рис. 1).

Для КТ характерна широкая полоса возбуждения флуоресценции, простирающаяся от УФ (300 нм) до красной области оптического спектра, и узкая симметричная полоса эмиссии в области 580-660 нм. Это позволяет получать люминесцентное  излучение в оранжево-красном диапазоне при возбуждении не только ультрафиолетом, но и светом в видимой области спектра [2].

Проведенное исследование воздействия светового потока на жизнеспособность культуры фибробластов линии NIH 3Т3 показало, что воздействие света ксеноновой лампы (группа СС) приводит к зависимому от дозы облучения фотоповреждению клеток (Рис.2).

При дозах облучения 0,3-19 Дж/см2 не наблюдается значимого различия в защитном действии материалов, отрезающих УФ-компоненту (СС-УФ), и материалов с квантовыми точками (ПСС). Однако, при повышении дозы облучения с 77 Дж/см2 до 231 Дж/см2 материалы, отрезающие УФ-компоненту, не справляются с защитой клеток, в то время как материалы с добавлением КТ полностью защищают клетки, оказывая даже незначительное стимулирующее воздействие по сравнению с интактным контролем, принятым за 100% (p ≤ 0,05). Эти данные показывают, что воздействие небольшой по интенсивности люминесцентной компоненты света оранжево-красного диапазона приводит к стимуляции внутриклеточных процессов, что приводит к  повышению жизнеспособности клеток. Эти данные подтверждают  гипотезу о биостимулирующем воздействии красного света [4].

Протекторный эффект от повреждающего действия солнечного света также был показан и на других типах клеток: эпителиальных клетках линии HEp2 и клетках роговицы глаза кролика SIRC (рис. 3).

Внешний вид клеток, облученных солнечным светом в присутствии и в отсутствие фильтров, представлен на рис. 4. Флуоресцентный краситель SYTO 9 окрашивает все клетки в зеленый цвет, иодид пропидия окрашивает ядра погибших клеток в красный цвет, что позволяет подсчитать процент гибели клеток под воздействием облучения.

Исследование показало, что максимальная гибель клеток (89%) наблюдается при воздействии света ксеноновой лампы (группа СС). При использовании экрана, отрезающего УФ-компоненту, количество мертвых клеток снижается до 36% (группа СС-УФ). При облучении преобразованным светом с дополнительной люминесцентной компонентой (группа ПСС) количество мертвых клеток такое же, как и в контроле (6% и 3% соответственно).

Вывод

Проведенное нами исследование показало, что наличие даже небольшой по интенсивности дополнительной люминесцентной компоненты (λмакс=626нм) в спектре солнечного света приводит к стимуляции внутриклеточных процессов и возможному повышению регенераторных возможностей организма. Светопреобразующие материалы позволяют использовать солнечный спектр для возбуждения квантовых точек и формирования дополнительной люминесцентной компоненты с λмакс=626нм, таким образом  можно говорить о возможности применения данных материалов в новой  технологии фототерапии, являющейся  альтернативой использованию лазеров и светодиодов.

Спектроскопические измерения выполнялись при поддержках стипендии Президента (СП-6350.2013.4) и гранта РФФИ (14-44-03672). Определение жизнеспособности и метаболической активности клеток проводили при поддержке РНФ (14-25-00055).

Рецензенты:

Гапеев А.Б., д.ф-м.н., проф., ФГБУН Институт биофизики клетки РАН,  г.Пущино;

Белова Н.А., д.б.н., ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г.Пущино.