Трансплантация органов и тканей является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины [3, 5, 7, 12]. Особенно остро на повестке дня стоит вопрос об адаптации пересаживаемых тканей организму реципиента [1, 4, 6, 8]. Главным препятствием на пути создания надежных способов длительной консервации органов (3 суток и более), а также организации банков - хранилищ органов являются биологические проблемы выживаемости клеток и органов в условиях ишемии, которая действует на донорские органы на всех этапах: в организме донора, при изъятии, консервации, в период трансплантации и даже в раннем посттрансплантационном периоде [2, 9, 10, 11, 13]. Поэтому методы консервации органов и тканей становятся важным разделом трансплантологии и являются вспомогательным мероприятием и этапом трансплантации. Известно, что способы консервирования органов и тканей зависят от вида воздействия на трансплантат.

1. Заместительное консервирование:

1) биологическая перфузия;

2) нормотермическая аппаратная перфузия.

2. Консервирование, подавляющее обмен веществ:

1) охлаждение до температуры, близкой к 0°С, в жидких солевых средах или в других жидкостях без питательных веществ;

2) гипотермическая перфузия;

3) проточный метод;

4) бесперфузионный метод.

3. Охлаждение в твердых средах до температуры близкой к 0°С;

4. Замораживание при температуре ниже 0°С:

1) при температуре от 1°С до -50°С;

2) при температуре от 51°С до -100°С;

3) при температуре от -101°С до -273°С;

4) замораживание с высушиванием (лиофилизация).

5. Комбинированное (заместительное или подавляющее обмен веществ) консервирование:

1) гипотермическая перфузия плазмозамещающими растворами;

2) гипотермия в сочетании с гипербарической оксигенацией;

3) сочетание гипотермии, гипербарической оксигенациии, перфузии;

4) бесперфузионное охлаждение до температуры, близкой к 0°С, в жидких средах, содержащих кровь, плазму, сахара, АТФ и др. [4, 15, 16].

Значительное место среди различных методов консервирования занимают жидкие консервирующие среды (изотонический и гипертонический растворы хлорида натрия, жидкость Тирода, раствор Тингера-Локка, слабые растворы карболовой кислоты, хлорамина, мертиолата, диоцида, фурацилина, формальдегида, глутаральдегида, этилового спирта). Целесообразность их применения связана с возможностью создания благоприятных условий для консервируемых тканей. Изотоничность, изогидричность, ионно-электролитная уравновешенность - вот те свойства, которые необходимы для сохранения тканей в физиологически полноценном состоянии [17, 18]. Использование жидких консервирующих сред мы считаем перспективным, потому что подбором составляющих их компонентов можно влиять на генетический код консервируемой ткани, сохранять ее в состоянии анабиоза, «когда жизнь приостанавливается, прерывается более или менее полно...» (П.Ю. Шмидт, 1955) под влиянием различных угнетающих условий, и, наконец, бороться с микробным загрязнением ткани.

Цель исследования

С помощью экспериментально-лабораторных исследований определить характер воздействия различных консервирующих растворов на органы и ткани для оценки эффективности современных методов заготовки биотрансплантатов.

Материал и методы исследования

Основной компонент всех консервирующих растворов и гелей - формалин, так как при использовании формалинизированных трансплантатов явления тканевой несовместимости устраняются. Исходя из важности этого вывода, было проведено лабораторное исследование иммунологической активности гомологичной кожи при воздействии на нее различными физическими и химическими средствами, нашедшими применение при консервировании тканей. Выбор кожи обусловлен ее активностью в антигенном отношении. Опыты осуществлялись по принятой методике: животных (кроликов) сенсибилизировали подкожным введением 1 мл экстракта кожи. Чрез 15-16 суток им внутривенно вводили разрешающую дозу того же экстракта в количестве 9-10 мл.

Методика приготовления экстракта: кожу гомогенизируют растиранием с толченым стеклом в ступке до получения абсолютно гомогенной кашицы. Растворимые белки извлекают физиологическим раствором путем прибавления его к гомогенату в отношении 2:1. Затем при непрерывном встряхивании сюда же добавляют эфир до полного насыщения гомогената. Пробирки с гомогенатом центрифугируют в течение 15 мин при охлаждении льдом с поваренной солью. Из трех слоев, образующихся после центрифугирования (эфир, экстракт, осадок), экстракт отсасывают и используют для изучения. Содержание белка в экстракте определялось рефрактометрически и в среднем составляло 1,48-1,54%. Экстракт изготовлен из свежей кожи (контрольная серия), высушенной, хранившейся при 2-4°C в 2‰-ном растворе хлорамина, растворе Люголя, 70°- и 96°-ном спиртах и 3%-ном формалине (опытные серии) при экспозиции 12 ч, 1, 3, 5, 10 суток.

Далее, по вышеописанной методике сенсибилизации с последующим введением разрешающей дозы мы изучили влияние 0,25-, 0,5-, 0,75-, 1-, 1,5- и 3%-ного растворов формальдегида при экспозиции от 12 ч до 10 суток на иммунологическую активность гомологичной кожи.

Существующим методам консервирования присуще весьма нежелательное явление - уменьшение запаса прочности костной ткани. Для ответа на вопрос, ухудшаются ли механические свойства кости, консервированной при помощи формалина, предпринято настоящее исследование. Испытывались свежая и консервированная (0,25-0,5%-ные растворы формалина от 1 суток до 6 месяцев) кость. Из консервированной кости выпиливались циркулярные фрагменты длиной 10 мм. Из многих методов объективной оценки механических свойств костной ткани мы остановили свой выбор на изучении прочности сжатию, так как давление является постоянным и самым сильным механическим фактором внешней среды. Прочность на сжатие (δ сж) представляет отношение усилия (P), вызывающего разрушение ткани, к площади ее поперечного сечения (F). Определение усилия, приводящего к разрушению кости, производилось на приборе, используемом для испытания механической прочности материалов.

Результаты

При введении разрешающей дозы экстракта из консервированной названными способами кожи (за исключением формалинизированной), независимо от экспозиции, у кроликов развивалась характерная клиническая картина анафилактического шока. Животные погибали через 50-150 с. На вскрытии обнаруживались однотипные изменения: переполнение правой половины сердца венозной кровью, резкая гиперемия печени, венозный застой в органах брюшной полости, спазм мочевого пузыря. Введение экстракта из формалинизированной кожи не вызывало смерти животных, что свидетельствует об изменении иммунологических свойств такой кожи.

Таблица 1

Воздействие физических и химических факторов на антигенную активность тканей

Фактор	+4°C	3%-ный р-р формалина		2%-ный р-р хлорамина	р-р Люголя		96°-ный спирт	70°-ный спирт		Неконсервированная ткань
Экспозиция	Реакция животного
1 сутки 3 суток 5 суток 10 суток	смерть - - -		нет - - -	смерть - - -	смерть - - -	смерть - - -			смерть - - -		смерть - - -

У контрольных кроликов уже к концу введения экстракта наблюдалась кратковременная адинамия, атония, затем следовала остановка дыхания на 10-15 с и ослабление сердечных сокращений. В течение 3-4 мин состояние животных постепенно возвращалось к исходному.

Таблица 2

Изменение антигенной активности тканей при консервации их в растворах формалина различных концентраций и при различной экспозиции.

Концентрация	0,25%	0,5%	0,75%	1%	1,5%	3%	Неконсервированная ткань
Экспозиция	Реакция животного
12 часов	очень сильная	сильная	слабая	очень слабая	очень слабая	нет	смерть
1 сутки	сильная	слабая	очень слабая	очень слабая	нет	-	-
3 суток	слабая	слабая	очень слабая	нет	-	-	-
5 суток	очень слабая	очень слабая	нет	-	-	-	-
10 суток	нет	нет	-	-	-	-	-

Результаты опытов учитывали по степени реакции кроликов на введение разрешающей дозы экстракта.

1. Очень сильная реакция - утрачивались роговичные рефлексы, падал мышечный тонус. В течение 1,5-2 мин после введения разрешающей дозы у кроликов обнаруживались явления адинамии, атонии скелетной мускулатуры при очень редком дыхании и резком ослаблении сердечных сокращений. Восстановление утраченных функций и возврат к исходному состоянию происходил в течение 5-7 мин.

2. Сильная реакция - не отмечались полная адинамия и атония скелетной мускулатуры, сохранялись роговичные рефлексы. Восстановление утраченных функций наступало через 3 мин.

3. Слабая реакция - сохранялись роговичные рефлексы, мышечный тонус. Резкое учащение сердцебиений и дыхания. Возврат к исходному состоянию через 1,5-2 мин.

4. Очень слабая реакция - незначительно учащались сердцебиение и дыхание.

Введение экстракта животным не сопровождалось реакцией при консервировании кожи в 0,25-0,5%-ных растворах формалина на 10-е сутки, при консервировании в 0,75-ном и 1%-ном растворах на 5-е сутки и, наконец, при консервировании в 1,5%-ном растворе на 3-и сутки.

Следовательно, изменение иммунологической активности гомологичной кожи при консервировании в растворах формалина слабых концентраций находится в прямо пропорциональной зависимости от процентного содержания формалина и экспозиции в консервирующем растворе. При испытании прочности на сжатие свежей и консервированной кости получены следующие результаты  (табл. 3).

Таблица 3

Механическая прочность консервированной костной ткани при различных концентрациях раствора формалина

Время	% раствора формалина
	0,25%-ный р-р	0,5%-ный р - р
3 суток	- 8,9-9,0 кг/мм²	- 8,8-9,1 кг/мм²
15 суток	- 8,8-9,0 кг/мм²	- 8,8-9,0 кг/мм²
1 месяц	- 8,8-8,9 кг/мм²	- 8,8-9,0 кг/мм²
2 месяца	- 8,7-9,1 кг/мм²	- 8,7-8,9 кг/мм²
3 месяца	- 8,5-8,8 кг/мм²	- 8,7-8,9 кг/мм²
4 месяца	- 8,7-8,8 кг/мм²	- 8,7-8,8 кг/мм²
5 месяцев	- 8,3-8,5 кг/мм²	- 8,6-8,7 кг/мм²
6 месяцев	- 8,0-8,2 кг/мм²	- 8,5-8,6 кг/мм²

Как видно, механическая прочность консервированной костной ткани уменьшается, причем снижение прочности на сжатие более заметно при использовании в качестве консерванта 0,25%-ного раствора формалина.

Заключение

Существующие методы консервации трансплантатов не позволяют сохранить все остеоиндуктивные мио-, нео- и реваскуляризующие свойства тканей, сохранить жизнеспособность клеток на протяжении всего срока консервации и тем самым исключить отторжение трансплантата от органа реципиента. Необходимо создание для консервируемых тканей условий, близких к нормальной жизнедеятельности организма. В связи с этим возникает необходимость поиска новой технологии стерилизации, консервации и транспортировки свободных кожно-мышечных, нервных, хрящевых, костных реваскуляризируемых трансплантатов, которая будет позволять заготавливать органы и ткани, создавать запасы трансплантатов в банке трансплантированных тканей для использования их по мере необходимости, производить обмен трансплантатами между различными медицинскими учреждениями, находящимися за многие сотни километров от места получения трансплантата.

Рецензенты:

Слетов А.А., д.м.н., профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Ставрополь;

Калиниченко А.А., д.м.н., главный врач клиники «Фитодент», г. Михайловск.