Фиксация тканей животных, растений и человека различными химическими реагентами представляет первый этап подготовки препаратов для микроскопии. Во время фиксации происходит остановка биохимических процессов в нативной ткани при условии максимального сохранения морфологической архитектуры тканей.

В большинстве случаев используются сложные фиксаторы, включающие смесь соединений с высокой химической активностью: органические растворители, окислители, восстановители, буферные системы, вещества, вызывающие конформационные изменения внутриклеточных макромолекул, и др. [9 и др.]. Многие составы и концентрации фиксирующих реагентов, входящих в сложные фиксаторы, определены эмпирическим путем, и механизмы взаимодействия реагентов между собой в фиксаторе и с фиксируемыми клетками часто не изучены. Это приводит к увеличению «неопределенности» полученных результатов [6].

Фиксатор, в состав которого входят хромовая кислота, формальдегид и ледяная уксусная кислота, в литературе известен как фиксатор Навашина. Данная смесь была предложена С.Г. Навашиным в 1912 году для гистологической фиксации растительных объектов и активно используется до настоящего времени [1; 3; 4].

Хорошо известно, что соединения Cr (VI) представляют сильные окислители, а формальдегид является активным восстановителем. Однако кинетика окислительно-восстановительных реакций в фиксаторе Навашина между хромовой кислотой, формальдегидом и уксусной кислотой не исследована, хотя все, кто использовал этот фиксатор, наблюдали быстрое и резкое изменение цвета фиксатора после слияния указанных реагентов.

В данной работе представлены результаты спектрального анализа восстановления Cr (VI) до Cr (III), и кинетики реакций, связанных с восстановлением хрома формальдегидом в присутствии уксусной кислоты (пропорции взаимодействующих реагентов соответствуют смеси фиксатора Навашина).

Материал и методы

Все измерения спектров изученных растворов проводились на спектрофотометрах Specord UV (Цейс, Германия) и Chimadzu UV-2401PC (Япония). Растворы готовились на дистиллированной воде из следующих реагентов: хромовый ангидрид, 37%-ный раствор формалина и ледяная уксусная кислота. Состав фиксатора Навашина: 1%-ный раствор CrO₃,

16%-ный раствор формалина и ледяная уксусная кислота в пропорции 10:4:1 (v/v). Концентрация хромовой кислоты в фиксаторе Навашина равна 7х10^-2 М.

Исходный раствор CrO₃ (концентрация 0,1 М) имеет значения оптической плотности (D) значительно выше 2,0. Чтобы записывать спектры поглощения раствора CrO₃ в пределах 1,4 D (шкала спектрофотометра Спекорд), использовались разбавление исходного раствора CrO₃ в 100 раз и кюветы толщиной 0,5 см. Аналогично измерялись спектры поглощения раствора фиксатора Навашина.

Измерение спектров в длинноволновой части спектра (ионы Cr (III)) проводилось без разведения исходного раствора фиксатора в кюветах толщиной 2 мм.

Результаты измерений

1. Спектр поглощения хромовой кислоты (водный раствор CrO₃)

Спектр поглощения хромовой кислоты в концентрации 10^-3 М имеет три полосы поглощения: два пика в ультрафиолетовой области - 258 нм и 351 нм и один, минорный, плохо разрешенный пик, в области 436 нм. В табл. 1 приведены цифровые значения D в области максимумов спектра (Шимадзу).

Таблица 1

Значения D в максимумах спектра раствора CrO₃

	D (толщина кюветы - 0,5 см)
	258 нм	351 нм	436 нм
1. Раствор CrO3 (10-3 М)	1,134	0,837	0,116
2. Раствор CrO3 (7х10-4 М) (фиксатор Навашина)	0,702	0,524	0,071

Результаты измерений калибровочных спектров растворов хромовой кислоты в диапазоне концентраций 10^-3 - 10^{-4 М и расчеты коэффициентов молярной экстинции (}e, л / моль× см) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Результаты измерения значений оптической плотности для разных концентраций CrO₃ и расчета коэффициента молярной экстинции (e, л / моль× см)

№	Вода, мл	Рас-твор CrO3 10-3 М, мл	Концен- трация, М	Кювета 0,5 см
				258 нм		351 нм		436 нм D
				D	e*	D	e*
1	9	1	10-4	0,10	2000	0,08	1600	0,01
2	8	2	2 х10-4	0,20	2000	0,16	1600	..
3	7	3	3 х10-4	0,31	2066	0,24	1600	..
4	6	4	4 х10-4	0,42	2100	0,31	1550	..
5	5	5	5 х10-4	0,52	2080	0,39	1560	..
6	4	6	6 х10-4	0,64	2133	0,46	1533	..
7	3	7	7 х10-4	0,74	2114	0,54	1542	..
8	2	8	8 х10-4	0,84	2100	0,62	1550	..
9	1	9	9 х10-4	0,94	2088	0,70	1555	..
10	0	10	10-3	1,06	2120	0,78	1560	0,10
* Расчет коэффициента молярной экстинции e = D/C×l, где D - оптическая плотность, С - концентрация моль/л и l - толщина кюветы в см

2. Спектры поглощения фиксатора Навашина:

а) измерение концентрации ионов хрома (VI). Как отмечено выше, из

свежеприготовленной смеси фиксатора Навашина бралась аликвота, разбавлялась в 100 раз, и сразу же регистрировался спектр разбавленного фиксатора в кювете толщиной 5 мм. Аналогично измерения проводились через разные промежутки времени. Результаты одного из опытов измерения динамики изменения спектров хромовой кислоты приведены в таблице 3.

Таблица 3

Динамика изменения оптической плотности раствора фиксатора Навашина в течение 48 часов после приготовления фиксатора

Состав раствора		Оптическая плотность D
		258 нм		351 нм		436 нм
1	10-3 М раствор CrO3	D	%	D	%	D	%
		1,12		0,82		0,14
2	Смесь Навашина (разбавление в 100 раз) 0.00*	0,78	100,0	0,66	100,0	0,10	100,0
3	-----«----- 3.30	0,38	48,7	0,26	39,4	0,04	40,0
4	-----«----- 6.30	0,32	41,0	0,20	30,3	0,04	40,0
5	-----«----- 9.30	0,28	35,9	0,16	24,2	0,02	20,0
6	-----«----- 24.00	0,24	30,8	0,04	6,1	0,02	20,0
7	-----«----- 27.30	0,22	28,2	0,04	6,1	0,02	20,0
8	-----«----- 30.30	0,22	28,2	0,04	6,1	0,02	20,0
9	-----«----- 33.00	0,18	23,1	0,04	6,1	0,02	20,0
10	-----«----- 48.00	0,18	23,1	0,03	4,5	0,02	20,0
* Время в часах от начала измерений

Из данных табл. 3 можно рассчитать начальную скорость изменения оптической плотности (в первые три часа): V (258 нм) = 0,01 D/ч; V (351 нм) = 0,009 D/ч и V (420 нм) = 0,0023 D/ч;

б) измерение концентрации ионов хрома (III). После приготовления в фиксаторе Навашина в спектрах появляется и нарастает максимум в области 580 нм. Данный максимум отражает накопление хрома (III). Результаты одного из опытов, в котором измерялась динамика положения максимума в области 580 нм в течение 48 часов, приведены в таблице 4.

Таблица 4

Динамика изменения оптической плотности фиксатора Навашина в области 580 нм

(толщина кюветы 2 мм)

Состав раствора		D	%
1	Смесь Навашина 0.00*	0,10	100,0
2	------«------ 3.30	0,26	260,0
3	------«------ 6.30	0.30	300,0
4	------«------ 9.30	0.46	460,0
5	------«------ 24.00	0,48	480,0
6	------«------ 27.30	0,50	500,0
7	------«------- 30.30	0,51	510,0
8	------«------ 33.00	0,53	530,0
9	------«------ 48.00	0,56	560,0

Начальная скорость изменения оптической плотности (в первые три часа) в области 580 нм равна V (580 нм) = 0,053 D/ч;

в) Измерение спектров поглощения фиксатора Навашина без уксусной кислоты в длинноволновой части спектра.

Через 24 часа после приготовления смеси фиксатора Навашина раствор приобретал отчетливый темно-зеленый цвет, осадка не наблюдалось. В связи с этим возникло предположение о возможности взаимодействия хрома (III) с уксусной кислотой с образованием ацетата хрома. Для проверки этого предположения были поставлены опыты, в которых вместо уксусной кислоты добавлялся эквивалентный объем дистиллированной воды. Показано, что нарастание оптической плотности раствора фиксатора Навашина без уксусной кислоты значительно ниже, чем в присутствии кислоты. Цвет раствора фиксатора Навашина не был зеленым в случае отсутствия уксусной кислоты даже через 15 и 20 суток после приготовления фиксатора.

Обсуждение результатов

1. Показано, что с момента смешивания реагентов фиксатора Навашина начинается окислительно-восстановительная реакция между компонентами смеси фиксатора. Происходит восстановление Cr (VI) до Cr (III). Восстановление Cr (VI) до Cr (III) должно сопровождаться образованием муравьиной кислоты и уменьшением концентрации формальдегида. Данные об окислительно-восстановительных потенциалах хроматов приведены в нескольких работах [см. 7].

2. Таким образом, фиксатор Навашина представляет неустойчивую в химическом отношении смесь, и фиксация происходит в нестационарном растворе переменного состава, включающем: хромовую кислоту, формальдегид, уксусную кислоту, муравьиную кислоту и ацетат хрома (III).

3. Через 24 часа наблюдается значительное образование Cr (III) и падение концентрации Cr (VI). Продукт реакции с максимумом поглощения в области 580 нм Cr (III), по-видимому, является ацетатом хрома (III).

4. Доказательством того, что максимум 580 нм в спектре фиксатора Навашина связан с образованием ацетата хрома, могут служить результаты двух работ. В патенте о синтезе ацетата хрома формула изобретения сформулирована следующим образом: «Способ получения ацетата хрома на основе хромового ангидрида, уксусной кислоты или ее водного раствора и раствора восстановителя, отличающийся тем, что в качестве раствора восстановителя используют раствор формальдегида... в трехступенчатом реакторе проточного типа...» [5].

Как показали Рудь и соавт., при смешивании растворов хромового ангидрида, уксусной кислоты и формальдегида получается ацетат хрома:

2CrO₃ + 6CH₃COOH + 3CHOH + 3H₂O ® 2(CH₃COO)₃Cr + 3CHOOH + 6H₂O.

Как следует из уравнения реакции, на 1 моль хромового ангидрида требуется 3 моля уксусной кислоты и 1,5 моля формальдегида. Такие условия и разные температуры реагентов (нагрев до 60-70 °С) необходимы для эффективного синтеза ацетата хрома. В фиксаторе Навашина соотношение реагентов следующее: на 1 моль хромового ангидрида приходится 20 молей формальдегида и 17 молей уксусной кислоты. Такое соотношение, т.е. излишек формальдегида и уксусной кислоты, приводит к быстрому восстановлению хрома VI до хрома III и образованию ацетата хрома даже при комнатной температуре.

В другой работе показано, что при восстановлении хрома (VI) в присутствии разных восстановителей (сульфит натрия, аскорбиновая кислота, пероксид водорода) в присутствии уксусной кислоты также образуется ацетат хрома (III) с максимумом поглощения 580-590 нм [2].

5. Действие хрома (III), в частности ацетата хрома, на морфологию клеток недостаточно изучено. Представляют интерес данные о том, что раствор ацетата хрома применяется в качестве протравы при окрашивании ситца. Также известна способность ацетата хрома образовывать сшивки полимерных цепей и регуляции гелеобразования полимерных материалов.

6. Крайне недостаточно данных относительно влияния на клетки муравьиной кислоты, неоднозначны данные о роли уксусной кислоты в составе сложных фиксаторов [10].

7. Известно, что скорость проникновения формальдегида и уксусной кислоты в ткани и модельные системы [6] значительно выше, чем хроматов, приблизительно в 3-4 раза [8]. В связи с этим можно предположить, что собственно фиксация ткани происходит в смеси формальдегида и уксусной кислоты, на фоне которой медленно проникают в ткань продукты восстановленного хрома и других соединений, возникающих в фиксаторе Навашина в ходе окислительно-восстановительной реакции.

8. Механизмы фиксирующего действия хромовой кислоты до конца не изучены. Возможны три варианта: а) прямое коагулирующее действие хроматов на белки, что приводит к их «стабилизации»; б) образование координационных связей с белками, что приводит к образованию прочных связей с протравными красителями (гематоксилин); в) в процессе действия хроматов на тканевые белки включаются оба указанных механизма.

9. На основе результатов данной работы можно предложить двухступенчатый протокол применения фиксатора Навашина: сначала проводить фиксацию в смеси формалин+уксусная кислота и затем, после тщательной промывки, провести обработку хромовой кислотой («хромирование» ткани). Наши данные показывают, что такой протокол фиксации позволит, во всяком случае, избежать действия на ткань дополнительных продуктов окислительно-восстановительной реакции внутри фиксатора Навашина.

Работа поддержана Грантом РФФИ (Проект № 14-08-00-295).

Рецензенты:

Брусков В.И., д.х.н., профессор, заведующий лабораторией, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино;

Мирошников А.И., д.б.н., в.н.с., Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино.