Рак легкого (РЛ) занимает одно из ведущих причин смертности среди онкологических заболеваний во многих странах мира. Понимание факторов, участвующих в этиологии рака легкого требуется для прогнозирования потенциальных групп риска, которые могут иметь существенное клиническое значение для разработки оптимальных схем лечения этого заболевания[1]. Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью этого заболевания, но и его традиционно поздней диагностикой [3].

В 2012 году во всем мире было зарегистрировано 1 825 000 новых случаев заболеваний РЛ.Из них -приблизительно 68% среди мужчин и32% - среди женщин. При этом общий показатель смертности составил 1 590 000 случаев (1 099 000 - среди мужчин, 491 000 - среди женщин) или почти 90%[5].Показатель распространенности заболеваемости РЛ в России в 2014 г. составил 90,6 на 100 000 населения с тенденцией к повышению, что обусловлено как ростом заболеваемости и выявляемости, так и с увеличением выживаемости онкологических больных [6].

Курение является на сегодняшний день основным источником рака легких. Сигаретный дым содержит по меньшей мере 73 известных канцерогена, в том числе бенза-пирен, нитрозамины (NNK), 1,3-бутадиен и α-радиоактивный изотоп полония, полоний-210. В мире 85-95% случаев РЛ этиологически связаны с курением у мужчин и 65-80 % РЛ -у женщин [9]. По данным отчета ВОЗ за 2011 г. распространенность РЛ среди курящих женщин составляет 38, а среди курящих мужчин - 125 на 100 тысяч населения, тогда как среди некурящих этот показатель равен 7 на 100 тысяч человек [10].

Открытие соматических мутаций в генеEGFR явилось ключевым моментом в разработке таргетного подхода лечения немелкоклеточного рака легкого и привело к необходимости скринингачувствительности/устойчивости клеток опухолей легкого к ингибиторам тирозинкиназ с использованием молекулярно-генетическихметодов[8]. Мутации в гене EGFR чаще обнаруживаются в аденокарциномах легкого у некурящих женщин. Однако мутации гена EGFR также могут обнаруживаться в других подгруппах пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), в том числе у бывших или настоящих курильщиков [2].

При сравнении пациентов с диким типом генаEGFR,пациенты с мутантным геном, получающие терапию ингибиторами тирозинкиназ, имеют более продолжительный период выживаемости, чем получающие химиотерапию. Медиана периода выживаемости у пациентов с метастатическим раком легкого с мутантным вариантом генаEGFR, получавшим лечение ингибиторами EGFR первого и второго поколения, составляет около 2-х лет [7].

ЮФО в совокупности с Северным Кавказом представляет собой уникальный регион с оседлым проживанием различных этносов. В связи с этим данное исследование может служить моделью для скрининга проявления частот мутаций в гене EGFR, что крайне важно для прогнозирования стандартов лечения и планирования скрининговых программ при использовании таргетных препаратов. Поэтому целью настоящего исследования являлось изучение закономерностей в частотах встречаемости 29 соматических мутаций в генеEGFRтканей опухолей пациентов Юга России с диагнозом «аденокарцинома легкого» и выявление ассоциаций обнаруженных мутацийс гендерной принадлежностьюи статусом курения.

Материалы и методы

В данное исследование были включены 435 пациентов с подтвержденным диагнозом «аденокарцинома легкого», получавших стационарное лечение в ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ. Проведен анализ в частотах проявления мутаций в гене EGFR с учетом гендерных особенностей и статуса курения.Мужчины - 278 человек (64%) из них: 105(37,7%) никогда не курили и 173(62,2%) курили.Женщины - всего 157 человек (36%) из которых никогда не курили - 145(92,3%), а курили - 12 (7,6%).

Для молекулярно-генетических исследований использовались FFPE блоки, фиксированные в 10% забуференном формалине, содержащие не менее 20% опухолевой ткани, из которых получали срезы толщиной 3 мкм. Экстракция ДНК проводилась после стандартной процедуры двойной депарафинизации срезов орто-ксилолом и спиртом, с использованием набора QIAamp® DNAFFPETissueKit (QIAGENE, Германия) согласно протоколу производителя. Концентрацию полученной ДНК из образцов измеряли на флюориметреQubit 2.0® с использованием набора Quant-iTTMdsDNAHigh-Sensitivity (HS) AssayKit (Invitrogen, США).Детекцию 29 соматических мутаций в гене EGFR проводили с помощью набора реагентов «TherescreenEGFRRGQPCRKit» (QIAGENE, Германия) с использованием термоциклераRotor-GeneQ (QIAGENE, Германия).

Статистический анализ проводили с использованием программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 7.Оценивали достоверность различий с использованием непараметрического критерия χ2, для общепринятого уровня статистической значимости р<0,05. Определяли различия в проявлении частот мутантного и дикого типов гена EGFR в группах пациентов,сгруппированныхна основании ихгендерной принадлежности и статуса курения.

Результаты и обсуждение

Согласно полученным в нашем исследовании данным, средняя частота встречаемости мутантного типа гена EGFR среди всех пациентов Юга России составила 25,7% (табл. 1).

Таблица1

Частоты встречаемости мутантного типа генаEGFR у мужчин и женщин

При анализе частоты встречаемости мутантного типа гена EGFR среди пациентов с учетом гендерного признака (без учёта статуса курения) замечено,что у пациентов мужского пола этот показатель cоставил 15,1%, что было в 3 раза меньше аналогичного показателя в группе пациентов женского пола - 44,5%. (χ2=45.60 р=0,0000). Полученные различия являются статистически достоверными для уровня значимости p<0.05. (Таблица 1).

На следующем этапе нашего исследованиячастоты встречаемости мутантного типа гена EGFR у пациентов с диагнозом «аденокарцинома легкого» были проанализированы с учётом статусакурения, но без учета гендерных различий (табл. 2).

Таблица 2

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRв зависимости от статуса курения

В группе не курящих пациентов Юга России частота встречаемости мутантного типа в гене EGFRсоставила  -35,6%, что почти в 3 раза больше, чем в группе курящих пациентов - 12,4% (χ2 =29,85; р= 0,0000). В рамках нашего исследования отличия мутантного типа в гене EGFR в группе курящих и не курящих пациентов независимо от пола являются статистически достоверными для уровня значимостир<0,05.Далее каждая гендерная группа была дополнительно проанализирована с учётом статуса курения пациентов. Группа пациентов мужского пола была разделена на курящих и тех, кто никогда не курил (табл.3).

Таблица 3

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRу мужчин в зависимости от статуса курения

В группе никогда не куривших мужчин частота встречаемости мутантного типа гена EGFR составила 21%, что в 19 раз превышало аналогичный показатель для группы курящих мужчин - 1,1%. Данные различия были статистически достоверны (χ2=4,49 р=0,0340) для уровня значимости р<0,05.

Группа пациентов женского пола была также разделена на куривших и никогда не куривших пациентов (Табл. 4).

Таблица 4

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRу женщин в зависимости от статуса курения

Частота проявления мутантного типа генаEGFRу женщин, которые никогда не курили, составила 46,2%, что почти в 2 раза выше по сравнению с аналогичной группой курящих женщин - 25% (χ2=2,02 р=0,1555), что соответствует даннымдругих исследований[4]. Однако полученные нами различия носили характер тенденции и не были статистически достоверными для уровня значимости р<0,05 в силу недостаточности анализируемых событий (всего 12 куривших женщин из 157 пациенток женского пола или 7,6%).

Также нами были проанализированы частоты встречаемости мутантного типа гена EGFR в зависимостиот статуса куренияигендерной принадлежности пациентов (Табл.5).

Таблица 5

Частоты встречаемости мутантного типа гена EGFRв зависимости от статуса курения в различных гендерных группах

Частота проявления мутантного типа гена EGFR у не курящих мужчин составила 21%, что в 2,2 раза меньше, чем в аналогичной группе женщин - 46,2% (χ2=16,94 р=0,0000). При этом у курящих мужчин частота встречаемости мутантного типа гена EGFRсоставила 1,1%, что почти в 23 раза меньше по сравнению с группой курящих женщин - 25% (χ2=1,86 р=0,1724). Однако такие большие различия носили характер тенденции, так как не были статистически достоверны для общепринятого уровня значимости (p<0.05). Мы объясняем это особенностью расчета критерия χ2, который требует наличия определенного количества зарегистрированных событий. В данном случае малочисленной оказалась группа курящих женщин (Таблица 5).

Заключение

Полученные в рамках данного исследования данные подтверждают высокую значимость статуса курения для частоты проявления мутаций в гене EGFR: частота проявляемости мутаций в гене EGFRу пациентов Юга России была существенно выше в группе не курящих пациентов. Нами выявлены статистически достоверные различия в частотах проявления мутаций в генеEGFRв различных гендерных группах пациентов Юга России с учетом статуса курения. Частота мутаций в гене EGFR (без учета статуса курения) среди мужчин составила 15,1%, что было в 3 раза меньше, чем частота встречаемости мутантного типа гена EGFR среди женщин - 44,5%. В ходе исследования выявлено, что частота мутаций в гене EGFRв группе мужчин, которые никогда не курили (21%), была в 19 раз больше, чем в аналогичной группе курящих мужчин (1,1%). Частота встречаемости мутантного типа генаEGFR в группе не курящих женщин была равна 46,2%, что практически в 2 раза больше, чем в аналогичной группе курящих женщин - 25%. В группе не курящих мужчин частота встречаемости мутантного типа гена EGFR составила 21%, что в 2,2 раза меньше, чем в группе не курящих женщин - 46,2%. При этом частота встречаемости мутантного типа гена EGFRу курящих мужчин в нашем исследовании составила величину 1,1%, что почти в 23 раза меньше, чем в группе курящих женщин - 25%.

Таким образом, значимым фактором в возникновении SNP - мутаций в гене EGFR является не только статус курения, но и гендерная принадлежность пациента. Это позволяет нам предположить, что возникновение соматических мутаций в гене EGFR усиливается женскими половыми гормонами.

Франциянц Е.М., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Горошинская И.А., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону.