Известно, что биохимический состав растений оказывает значительное влияние на степень предпочтения субстрата, их выживаемость и степень дефолиации крон древесных растений [5]. Вследствие этого параметры энтоморезистентности растений являются ключевыми, детерминирующими как возможность реализации вспышек массового размножения лесных насекомых-фитофагов, так и степень дефолиации крон и площади очагов [1]. Энтоморезистентность дифференцируется на конститутивную и индуцированную [9;12]. Конститутивная энтоморезистентность (природная) является генетически детерминируемой неповреждаемостью их насекомыми. На биохимическом уровне она обусловлена содержанием в хвое и листьях соединений, которые вызывают избегание и непредпочитаемость насекомыми этих растений [9;11]. Нередко они являются токсичными для насекомых (например: алкалоиды) [6]. Индуцированная энтоморезистентность активируется воздействием на растения различных экзогенных биотических и абиотических факторов [9;11]. При этом если биохимические аспекты механизмов индуцированной энтоморезистентности изучаются очень интенсивно [2; 3; 7; 9; 12; 13], то биохимические аспекты конститутивной энтоморезистентности изучены значительно меньше. Исходя из этого, биохимические аспекты конститутивной энтоморезистентности и были задачей данного исследования. Ранее этот вопрос нами изучался [4], но особенности сезонной динамики фенольных соединений (особенно фенолгликозидов, в значительной степени детерминирующих параметры энтоморезистентности у растений [10]) и количественные параметры изменения антиоксидантной активности не исследовались.

Материалы и методы

Для хроматографического анализа 20 мая был проведен сбор листьев березы повислой как из локальных затухших очаговмассового размножения непарного шелкопряда на пробных площадях с ежегодно регистрируемым процентом дефолиации крон, так и за границами очагов, где в течение 30 лет отсутствовала дефолиация. Взятие каждой пробы осуществлялось от нескольких деревьев. Затем пробы смешивались для получения средней пробы. Очаги массового размножения находились в Каменск-Уральском районе Свердловской области. Пробные площади располагались в березняках вблизи пос. Покровское. Контрольные пробы взяты в березняках вблизи пос. Храмцовское, растущих в сходных лесорастительных условиях.

Сразу после сбора листья березы высушивали при 60 °С, затем размалывали. Навеску с 2 г размолотых листьев смешивали с 20 мл 95 % этанола. Экстракцию фенольных соединений из листьев березы проводили в обратном холодильнике на водяной бане в течение 30 мин при кипении раствора. После этого суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 со спектрофотометрическим УФ-детектором. Детектирование элюента осуществляли одновременно на двух полосах поглощения: 254 и 360 нм на хроматографической колонке PerfectSil Target ODS-35мкм с обращенной фазой, размером 250 х 4,6 мм. Градиентное элюирование проводилось в диапазоне 10–50 % со скоростью 1 мл/мин при температуре 40 °С. Элюент А – ацетонитрил – 0,05 М фосфатный буферный раствор (рН=3,0); элюент В – ацетонитрил-вода (9:1). Продолжительность хроматографического анализа – 45 мин при 40 °С. Из них от 0 до 30 мин проводилось градиентное элюирование в диапазоне 10–50 %, затем в течение 15 мин при концентрации 50 %. Для идентификации фенольных соединений использовали вещества-свидетели фирм: Fluka, Sigma, Aldrich: апигенин, аскорбиновая к-та, арбутин, гиперозид, галловая к-та, гидрохинон, кверцетин, изокверцетин, изокверцитрин, кафтаровая к-та, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид, рутин, феруловая к-та, 4-кофеоилхинная к-та, 5-кофеоилхинная к-та, кемпферол, мирицетин, салицин, салидрозид.

Результаты

Градиентный хроматографический анализ (ВЭЖХ) образцов из листьев березы повислой, взятых как в затухших очагах непарного шелкопряда, так и за их границами, выявил 75 фенольных соединения (рис. 1).

Рис. 1. ВЭЖХ фенольных соединений из листьев березы повислой в затухших очагах непарного шелкопряда

Из общего количества фракций нами идентифицировано 18 фенольных соединений. Список идентифицированных нами фенольных соединений в листьях березы представлен в таблице. По химическому составу это были флавоноиды, фенолгликозиды, фенолкарбоновые и гидроксикоричные кислоты.

Нами был проведен как тотальный сравнительный количественный попарный анализ основных, выявленных при хроматографии пиков, так и сравнительный анализ идентифицированных нами фенольных соединений (таблица, рис. 2).

Сравнительный анализ содержания идентифицированных фенольных соединений в листьях березы повислой в очагах непарного шелкопряда и за их границами

Как показали результаты сравнительного анализа образцов листьев из очагов и контрольных древостоев (за границами очагов), они значительно отличались между собой (рис. 2). Так, за границами очагов у 37,3 % хроматографических пиков содержание фенольных соединений заметно возрастало, по сравнению с образцами из затухших очагов, у 56 % пиков содержание снижалось, у 5,97 % – не изменялось (рис. 2).

Сравнительный попарный анализ идентифицированных фенольных соединений продемонстрировал другие результаты. Так, за границами очагов у 52,94 % хроматографических пиков содержание фенольных соединений заметно возрастало, по сравнению с образцами из затухших очагов, у 35,29 % пиков содержание снижалось, у 11,76 % – не изменялось (рис. 2, таблица). Особенно большой интерес среди группы идентифицированных соединений представляют фенолгликозиды, так как известно, что они обладают антифидантными свойствами [6; 10].

Рис. 2. Соотношение фенольных соединений при тотальном попарном анализе пиков хроматограмм из листьев березы (1,2) за границами очагов (1,4), в затухших очагах (2,5) и идентифицированных фенольных соединений (4,5)

По вертикали: изменение содержания фенольных соединений в пробе (в %). Слева направо: 1 – возрастание, 2 – снижение, 3 – отсутствие изменений.

Сравнительный анализ содержания фенолгликозидов в листьях березы из затухших очагов и за их границами показал, что содержание арбутина в пробах, взятых вне очагов, возрастало на 25,88 %, салицина на 98,38 %, содержание салидрозида, наоборот, снижалось на 24,68 %, лютеолина – на 53,49 % (рис. 2).

Для более точного сравнительного анализа основных тенденций изменения содержания фенольных соединений в листьях березы в затухших очагах и за их границами нами во всех пробах были исключены минорные фракции. Как показали результаты, у 36,1 % фенольных соединений их содержание заметно возрастало, у 50 % – снижалось, у 13,88 % не изменялось.

Следовательно, основной тенденцией у мажорных фракций фенольных соединений за границами очагов было снижение содержания, хотя и количество соединений с заметным возрастанием концентрации также было высоким.

Сравнительный анализ содержания фенольных соединений с данными предыдущего исследования, пробы для которого были взяты позже, показал, что по абсолютному содержанию пробы, взятые позже (в июле-августе), содержали более высокое количество идентичных соединений. Это, в целом, совпадает с результатами ряда других исследований, показавших, что к концу сезона вегетации содержание ряда соединений в листьях возрастает к концу сезона вегетации [8].

В целом, как показали результаты исследований при сравнительном анализе как тотальных фракций фенольных соединений в листьях березы, так и идентифицированных, наблюдаются разнонаправленные процессы: как снижение содержания фенольных соединений в листьях березы за границами очагов, так и их возрастание. При этом у многих фенольных соединений уровень этих изменений очень значителен (рис. 2, таблица). Доминирующей тенденцией при тотальном анализе фракций было снижение содержания фенольных соединений. Обращает внимание, что основная тенденция сохраняется и при элиминации из выборки минорных фракций, хотя количественно она снижается. Анализ идентифицированных фенольных соединений демонстрирует другую картину соотношений фракций – доминирование соединений, содержание которых возрастает в образцах, взятых за границами очагов. В предыдущем исследовании наблюдалась другая тенденция – незначительное преобладание количества фенольных соединений, содержание которых возрастало за границами очагов [4]. Эти различия могут объясняться как разным временем взятия проб, так и различными климатическими условиями в разные годы. Сравнительный анализ климатических условий весной и летом 2014 г. [4] и 2016 г. убедительно показал, что в мае 2014 г. наблюдалась умеренная засуха (ГТК=0,415), июне и июле, наоборот, ГТК было заметно выше нормы (1,54 и 1,88). В 2016 г. в мае отмечалась интенсивная засуха (ГТК=0,159), в июне ГТК была в норме (1,17), июле – умеренная засуха (ГТК=0,497). Мы предполагаем, что столь разнонаправленные тенденции обусловлены тем, что одновременно наблюдаются два биохимических процесса: Это реакция на фактор абиотического стресса (сильную майскую засуху) и активизация антиоксидантных процессов в листьях, которая всегда наблюдается при воздействии сильной засухи. Как установлено нами ранее, более интенсивная реакция на фактор абиотического стресса (сильную майскую засуху) наблюдается в березняках в затухших очагах [4]. Она проявляется в ингибировании синтеза фенольных соединений. Вторая реакция (активизации процессов антиоксидантной защиты) сопровождается возрастанием интенсивности синтеза фенольных соединений, так как известно, что многие флавоноиды являются мощными антиоксидантами [8]. Для проверки этого предположения мы провели сравнительный анализ соотношения идентифицированных нами фенольных соединений, обладающих по данным литературы антиоксидантной активностью в затухших очагах и за их границами. Как показали результаты, в контрольных насаждениях заметное возрастание антиоксидантной активности наблюдалось у 60 % фенольных соединений, снижение – у 33,3 %, отсутствие изменений – у 6,67 % (таблица). Соответственно, в затухших очагах возрастание содержания фенольных соединений с антиоксидантной активностью выявлено лишь у 33,3 % фракций. Таким образом, в низкорезистентных насаждениях доминировало ингибирование синтеза фенольных соединений, тогда как в высокорезистентных – антиоксидантная реакция. Тем не менее, в целом, доминирование в составе фенольных соединений у образцов, взятых за границами очагов, у которых содержание заметно возрастает (у идентифицированных соединений), а также заметное возрастание активности синтеза таких фенолгликозидов, как арбутин и салицин, детерминирующих уровень энтоморезистентности в листьях, свидетельствует о том, что в древостоях за границами очагов, где постоянно отсутствует дефолиация, и в период депрессии численности насекомых наблюдается более высокий постоянный уровень конститутивной резистентности.