С современных позиций нормальную микрофлору рассматривают как совокупность микробиоценозов, занимающих свои экологические ниши на коже и слизистых оболочках человека. Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, состоят между собой в разнообразных взаимоотношениях (нейтрализма, конкуренции, мутуализма, комменсализма, синергизма, паразитизма, синтрофии и др.). Изменение численности того или иного вида микроорганизмов в определенном биотопе или возникновение не свойственного данному месту обитания вида служит сигналом для адаптационных или необратимых изменений в соответствующем звене микроэкологической системы [1, 6].

Состав нормальной микрофлоры половых путей женщин достаточно изучен [1, 6, 8, 9]. Многообразие ее видового соотношения представлено строгими и факультативными анаэробами и в значительно меньшей степени — аэробными и микроаэрофильными микроорганизмами.

Характерными представителями микрофлоры половых путей здоровых женщин являются лактобактерии. Они обеспечивают защитный механизм конкуренции с патогенными микроорганизмами и поддерживают кислую среду во влагалище, создавая неблагоприятные условия для развития патогенной микрофлоры. Кроме лактобактерий, к нормальной микрофлоре влагалища относятся грамположительные палочки: эубактерии и несколько реже – бифидобактерии. Среди анаэробов в женских половых путях чаще всего встречаются три основных вида микроорганизмов: Bacteroides spp., Peptococcus и Peptostreptococcus, а также Clostridium spp. [12, 3]. Анаэробные бактерии наряду с аэробными бактериями являются частицей сложной микроэкологической системы, которая находится в определенном равновесии, содействуя нормальному функционированию половых органов в разные периоды жизни женщины (табл. 1).

Таблица 1

Видовой состав нормальной микрофлоры влагалища (Кира Е.Ф., 2001)

Формирование и становление микробиоценоза влагалища в различные периоды жизни женщины неодинаковы и отражают влияние комплекса факторов внутренней и внешней среды.

На данный момент известно, что наиболее часто в качестве представителей аэробной и факультативно анаэробной микрофлоры обнаруживают эпидермальных и сапрофитных стафилококков, реже — кишечную палочку и энтеробактерии, в единичных случаях — бифидобактерии и лактобактерии. У 70% здоровых девочек в состав индигенной микрофлоры влагалища входят бактерии с гемолитическими свойствами. Общее микробное число у девочек от 1 месяца до 7–8 лет жизни составляет от 10² КОЕ/мл до 10⁵ КОЕ/мл [4, 10, 11].

В составе микрофлоры влагалища девочек препубертатного возраста (9–12 лет) вплоть до менархе преобладают анаэробные и микроаэрофильные микроорганизмы: бактероиды, стафилококки, дифтероиды. Отмечают большое количество лактобактерий и молочнокислых стрептококков. В этот период микробиоценоз влагалища относительно стабилен. C момента активации овариальной функции организм девушки синтезирует «собственные», эндогенные эстрогены. Под влиянием эстрогенов клетки эпителия влагалища накапливают гликоген. Это приводит к формированию эстрогенстимулированного эпителия. На поверхности эпителиоцитов влагалища увеличено число рецепторных участков для адгезии лактобактерий, увеличивается толщина эпителиального слоя. С этого момента лактобактерии — доминирующие микроорганизмы микрофлоры влагалища, и в последующем они сохранят это положение на протяжении всего репродуктивного периода. Метаболизм лактобактерий способствует стабильному сдвигу рН среды влагалища в кислую сторону до 3,8–4,5. Общее микробное число составляет 10⁵–10⁷ КОЕ/мл.

Пубертатный, или подростковый, период характеризует ритмичная физиологическая гипертранссудация в виде слизистых выделений. Увеличено количество эпителиальных слоев, а кольпоцитологическая картина приближена к таковой у взрослой женщины. Общее микробное число составляет 10⁵–10⁷ КОЕ/мл. В 60% случаев определяют лактобациллы, среда влагалища становится кислой, рН 4,0–4,5 [4, 10, 11].

На современном этапе много исследований посвящено изучению микроценоза влагалища, но наряду с этим крайне мало данных о видовом соотношении микроорганизмов. Учитывая важность учета количественного состава аэробных и анаэробных сообществ для дифференциальной диагностики патологических состояний в детском возрасте, нами проведено исследование, целью которого стало изучение частоты встречаемости, а также соотношение аэробной, факультативно анаэробной микрофлоры, облигатного сообщества микроорганизмов влагалища и факультативных анаэробов в различные периоды полового созревания.

Задачи

1. Сформировать группы девочек, участвующих в исследовании, учитывая этапы формирования репродуктивной системы.
2. Определить микробиологические характеристики влагалища методом комплексной количественной полимеразной цепной реакции с использованием тест-систем «Фемофлор-17» в группах девочек от 0 до 7 лет, от 8 лет до менархе, от менархе до 18 лет.
3. Выявить закономерности изменения соотношения видового состава влагалищного биотопа у здоровых девочек в периоде детства, препубертата и пубертата.

Материалы и методы исследования

Взятие биоматериала осуществлялось на базе детского поликлинического отделения № 1 ГБУЗ СО СГП № 13 с февраля по август 2015 г., при подписании пациенткой или законным представителем информированного согласия на проведение исследования.

Количество обследованных девочек составило 226 человек, из них девочек от 0 до 7 лет – 74 человека, от 8 лет до менархе – 37, от менархе до 18 лет – 115. Критерии возрастного интервала выбранных групп были обусловлены основными этапами формирования репродуктивной системы.

Критерии включения: здоровые девочки, проходившие профилактический осмотр с отсутствием жалоб, неизмененной слизистой влагалища, а также физиологическими выделениями из половых путей.

Критерии исключения: применение антибактериальных препаратов за месяц до обследования, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии и наличие острых воспалительных заболеваний на момент осмотра и забора материала.

Исследование состояния влагалищного микробиоценоза проводили при помощи комплексной количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-систем «Фемофлор-17» (производства ООО «НПО ДНК-Технология», Россия).

Материалом для исследования методом комплексной количественной ПЦР у девочек являлся соскоб эпителиальных клеток, который забирался из заднего свода влагалища через гименальное кольцо. Хранение материала осуществлялось при температуре 2–8°С не более 8 ч, далее при температуре –20°С в течение 1 месяца или при температуре –70°С в течение 1 года.

Всего исследовано 226 образцов соскобов отделяемого слизистой влагалища. Спектр диагностируемых показателей включал КВМ (контроль взятия материала), ОБМ (общая бактериальная масса), наличие микоплазм (Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp.), дрожжеподобных грибов (Candida spp.);  Lactobacillus spp., (Enterobacterium spp., Streptococcus spp., Staphylococcus spp.), (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp., Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp., Lachnobacterium spp./Clostridium spp., Mobiluncus spp./Corinebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), а также идентификацию патогенов (Mycoplasma genitalium).

Заключение по результатам диагностического теста Real-Time PCR получали в виде диаграммы, которая описывала вид микробной флоры влагалища.

Рассчитывали абсолютные (в логарифмах полученных показателей бактериальной массы условно-патогенного организма Lg₁₀УПМ) и относительные показатели (разница логарифмов полученных показателей общей бактериальной массы условно-патогенного организма (УПМ) и общей бактериальной массы (ОБМ) — Lg₁₀УПМ – Lg₁₀ОБМ). Оценку наличия Candida spp., Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Mycoplasma genitalium проводили только в абсолютных показателях.

При оценке состава условно-патогенной флоры учитывалось не только ее присутствие, но и количество по отношению к общей бактериальной массе (ОБМ). Также определялось количество лактобактерий по отношению к общей бактериальной массе.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерного программного пакета (Microsoft Office Excel 2007).

Результаты исследования                                                                                          

Проанализировав частоту встречаемости и количественное содержание аэробной и факультативно анаэробной микрофлоры, облигатного сообщества микроорганизмов влагалища и факультативных анаэробов, мы определили, что у девочек нейтрального возраста микрофлора влагалища характеризуется преобладанием облигатных анаэробов (табл. 2), Lg₁₀ которых соответствует 5,87±0,13. Относительное содержание  данной группы микроорганизмов в этом возрастном периоде 92,24±2,19. Аэробы и факультативные анаэробы встречаются в микроценозе влагалища в 71,6% случаев. Относительное содержание незначительное и составляет 7,32±2,17.

Таблица 2

Соотношения видового состава микрофлоры девочек нейтрального возраста

В препубертатном периоде происходит увеличение встречаемости и количества аэробов и факультативных анаэробов (табл. 3), тогда как встречаемость и количество анаэробной микрофлоры не меняются. При этом относительное содержание абсолютных анаэробов снижается от 92,24±2,19 до 56,50±7,76.

Таблица 3

Соотношения видового состава микрофлоры девочек в препубертатном периоде

С менархе у девочек в составе микроценоза влагалища происходит увеличение встречаемости аэробной и анаэробной микрофлоры (табл. 4). Количество аэробной микрофлоры увеличивается с 5,34±0,32 в препубертатном периоде до 7,10±0,13 с началом менструальной функции. Относительное содержание групп микроорганизмов меняется в сторону преобладания аэробных микроорганизмов 68,43±3,83.

Таблица 4

Соотношения видового состава микрофлоры девочек в пубертатном периоде

Сравнительный анализ абсолютного и относительного содержания микроорганизмов и соотношение долей во влагалище девочек разной возрастной группы представлены в таблице  5.

Достоверные различия в абсолютном содержании аэробов во влагалищном биоценозе выявлены среди всех групп обследованных. Так, у девочек нейтрального периода самое низкое содержание аэробов (4,10±0,11), тогда как в препубертатном периоде эти значения возрастают до 5,34±0,32 (р<0,001), а в периоде пубертата аэробные микроорганизмы увеличиваются относительно препубертатного возраста до 7,10±0,13 (р<0,001).

Относительное содержание микробов во влагалище девочек разных возрастов показало, что с периодом взросления происходит достоверное увеличение содержание аэробов. В 6 раз увеличивается содержание аэробов у девочек препубертатного периода (р<0,001), в 1,6 раза происходит увеличение количества между препубертатным и пубертатным периодом (0,008).

Обратные изменения прослеживаются в группе анаэробов. В нейтральном периоде максимальное содержание анаэробов 92,24±2,19. В возрасте 7 лет и до менархе количество анаэробов снижается в 1,6 раза (р<0,002), и с наступлением первой менструации происходит снижение микроорганизмов еще в 1,8 раза (р<0,008).

Таблица 5

Сравнительный анализ абсолютного и относительного содержания микроорганизмов и соотношение долей во влагалище девочек разной возрастной группы

Изучив относительное и абсолютное содержание сообществ микроорганизмов у девочек в различные периоды полового развития, необходимо подчеркнуть, что основные изменения микробиоты влагалища происходят в препубертатном периоде. Можно предположить, что это связано с началом функционирования гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы.