Для рака пищевода характерен высокий потенциал раннего лимфогенного метастазирования. Частота лимфогенного метастазирования при прорастании опухолью адвентиции и окружающих структур достоверно выше, чем при заинтересованности слизисто-подслизистого и мышечного слоев стенки пищевода [3]. В основе прогнозирования течения и исхода опухолевого процесса лежат факторы, определяющие распространённость опухолевого процесса, характеризующие биологические свойства первичной опухоли, отражающие характер взаимодействия опухоли и организма. Молекулярный механизм, лежащий в основе метастазирования – разрушение окружающей опухоль базальной мембраны и межклеточного матрикса ассоциированными с ней протеазами. В процессе канцерогенеза нормальная регуляция деградации экстрацеллюлярного матрикса нарушается, патологическая активация регуляторных белков освобождает опухолевые клетки, способствуя метастазированию. Протеиназы участвуют и в опухолевом ангиогенезе, обеспечивая миграцию клеток и построение новых капилляров. Большое значение в этих процессах придаётся матриксным металлопротеиназам, большинство которых активируется плазмином [7]. Процесс образования плазмина представляет собой каскадный цикл, регулируемый реципрокно. В опухолях различного генеза продемонстрировано увеличение экспрессии компонентов каскада активации плазминогена, причем активация происходит по паракринному механизму с участием факторов роста и цитокинов, выделяемых инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, а также клетками опухолевой стромы [8; 10; 14]. Центральную роль в этом процессе играет активатор плазминогена урокиназного типа (урокиназа, uPA), роль тканевого активатора плазминогена (тромбокиназы, tPA) уточняется. Активность uPA и tPA блокируется двумя серпинами: PAI-1 и PAI-2. Концентрация PAI-1 на порядок выше, чем PAI-2, и ему придаётся решающее значение в контроле активности uPA и tPA [4; 9]. Показано, что высокие уровни uPA и PAI-1 являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза, более значимыми, чем степень злокачественности, размер опухоли и содержание в ней рецепторов [5; 8; 9; 11]. При плоскоклеточном раке пищевода эти вопросы требуют тщательного изучения.

Цель исследования. Изучение системы фибринолиза в тканях плоскоклеточного рака пищевода у мужчин при наличии метастазов (mts) в лимфоузлы и без таковых.

Материалы и методы исследования. Перед началом работы получено разрешение этического комитета РНИОИ и информированное согласие 39 пациентов, поступивших на лечение, на использование для научных исследований биологического материала, доставленного из операционной. Методом ИФА с использованием стандартных тест-наборов ELISA исследованы РАР, uPA, tPA, PAI-1 в опухолевой ткани плоскоклеточного рака  пищевода, её перифокальной зоне: 39 мужчин, из них 17 с mts в лимфоузлы, st II, G2, T_2-3N_1-2M₀; 22 – без mts: 38-72 лет, st II, G2, T_2-3N₀M₀. Гистологический контроль проводился во всех случаях. Плазминоген (ПГ) и свободный плазмин (П) определяли спектрофотометрическим методом. Результаты сравнивали с гистологически неизменённой тканью из области линии резекции, которую считали условно здоровой. Все компоненты определяли в 10% гомогенатах, на стерильном физиологическом растворе, с последующим пересчётом на 1 г влажной ткани. Статистика: сертифицированная прикладная программа Statistica v. 10. Достоверность различий между количественными показателями вычисляли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Установлено, что ткань из области линии резекции у выделенных групп мужчин достоверно различалась по большинству изученных показателей (табл.). Исключением стал только PAI-1, содержание и активность которого не имели различий. По линии резекции опухоли с mts количество uPA-АГ выше в 1,5 раза, а uPA-акт – в 1,3 раза ниже, чем в области линии резекции опухоли, не давшей mts. Содержание tPA-АГ и tPA-акт здесь в 1,9 раза каждого выше, чем по линии резекции опухоли, не давшей mts. Количество ПГ в области линии резекции опухоли с mts в 2,0 раза ниже, а П – в 1,9 раза выше, чем в области линии резекции опухоли без mts. По содержанию плазмина, связанного с α₂-антиплазмином (РАР), можно судить как о количестве связанного фермента, так и ингибитора. Высокое содержание свободного П в ткани по линии резекции опухоли с mts, с преобладанием в 1,4 раза РАР, сравнительно с аналогичной тканью при отсутствии mts, может свидетельствовать о защитной протеолитической реакции, связанной с реализацией санирующих и биологических свойств П в межклеточных пространствах и мобилизацией α₂-антиплазмина, который уже подавлен в само́й опухоли и её перифокальной зоне (табл.).

В ткани, непосредственно прилежащей к опухоли плоскоклеточного рака пищевода (перифокальной зоне), не обнаружено различий по количеству РАР. Содержание остальных компонентов было у мужчин с mts достоверно увеличено: uPA-АГ и uPA-акт – в 1,6 раза каждого, tPA-АГ и tPA-акт – в 1,4 и 1,9 раза, PAI-1-АГ и PAI-1-акт – в 2,4 и 6,0 раз сравнительно с аналогичной тканью мужчин без mts. Только содержание ПГ, при одновременном увеличении активности П в 1,9 раза от ткани по линии резекции, было в 2,1 раза ниже относительно перитуморальной ткани мужчин без mts.

В ткани опухоли у мужчин с mts в лимфоузлы количество ПГ сравнимо с таковым в области линии резекции и перифокальной зоны, а П – в 1,8 раза ниже, чем в ткани по линии резекции, и в 3,5 раза – чем в её перифокальной зоне. В ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода у мужчин без mts количество ПГ и П достоверно повышено в 1,4 и 3,4 раза, сравнительно с областью линии её резекции и в 1,6 и 1,2 (р<0,05) раза относительно её перифокальной зоны. 

Тканевая фибринолитическая система при раке пищевода у мужчин

Примечание: индекс достоверности соответствует номеру столбца, с которым сравнивали числовые значения (р<0,05);

¹mts – метастазы.

Содержание РАР в опухоли при наличии mts было в 1,3 раза ниже, чем в ткани из области её линии резекции, и сравнимо со всеми остальными образцами.

Количество обеих форм uPA и PAI-1 в опухоли больных с mts многократно превосходило их содержание в ткани по линии резекции и перитуморальной зоны (табл.). В опухолях больных без mts количество обеих форм uPA и PAI-1 также было достоверно выше, чем в ткани по линии их резекции и перифокальной зоны.

Что касается tPA, то в опухоли, давшей mts, этот активатор ПГ был истощён, а в опухоли без mts – снижено образование tPA-акт, а именно: tPA-АГ при наличии mts в 2,3 раза ниже, чем в области линии резекции, а tPA-акт – в 3,5 раза. У мужчин без mts tPA-АГ в 1,8 раза выше, чем по линии резекции, а tPA-акт – в 5,3 раза ниже.

Согласно нашим результатам, наибольшее количество PAI-1 и uPA содержалось в опухолевой ткани как при наличии mts в лимфоузлах, так и без них, с достоверными различиями между группами (табл.). Обе формы PAI-1 были резко повышены в опухоли сравнительно с тканью по линии резекции у всех больных (табл.). Известно, что уровень PAI-1 повышается при воспалительных заболеваниях и раке [6; 8; 9]. Из многих сообщений следует, что содержание PAI-1 при исследованных локализациях рака достоверно повышено в туморозном очаге сравнительно с гистологически неизмененной тканью [8; 9; 11]. Авторы подчёркивают, что высокая концентрация PAI-1 в опухолевой ткани коррелирует с ухудшением течения заболевания у больных раком толстой и прямой кишки, желудка, молочной железы, яичников и др., предлагается использование PAI-1 в качестве прогностического маркера течения злокачественного процесса. Есть сведения, что злокачественные клетки секретируют раковые прокоагулянты, активаторы и ингибиторы фибринолиза, их рецепторы и др. [1; 13; 14].

Накопление uPA-АГ в ткани опухоли у всех мужчин, сравнительно с перифокальной тканью и областью линии резекции, предполагает усиленное образование урокиназы в этой ткани с последующей активацией ПГ, но между группами с mts и без таковых замечены достоверные различия по упомянутым компонентам. Количество uPA-АГ в опухоли, давшей mts, в 127 раз больше, чем uPA-акт, и в 1,7 раза выше, чем в опухоли без mts. С другой стороны, содержание uPA-акт в опухоли, не давшей метастазов, в 3,4 раза выше, чем в опухоли с mts. Урокиназа известна своим влиянием на ПГ и способностью усиливать процессы клеточной пролиферации [8; 14].

Увеличение tPA-АГ регистрировалось только в опухоли без mts, образование tPA-акт здесь было затруднено (табл.). В метастазирующей опухоли (как более поздней стадии её развития), по-видимому, накопление tPA-АГ прекращалось, содержание tPA-акт было в 2,8 раза выше, чем в опухоли без mts, но почти в 2 раза ниже, чем в области линии резекции. Тромбокиназа (tPA), совместно с другими коагулянтами и фибринолитическими протеиназами, помимо роли в гомеостазе фибрина, оказывает мощное провоспалительное действие и инициирует ремоделирование при патологии, в том числе раке [13].

Низкое содержание ПГ и П в опухоли, имеющей mts, коррелирует с количеством урокиназы (r₁=0,863; r₂=0,874), но с уровнем tPA положительной связи не обнаружено (табл.). Активация ПГ и образование П в опухоли, давшей mts, очевидно, достигли своего пика – истощения системы, – это единственное объяснение малого количества ПГ и П в туморозном очаге. Плазмин, помимо своей основной функции растворения фибрина, разжижает межклеточный матрикс, повреждает гистогематические барьеры и клеточные мембраны, является непосредственным активатором проферментов сериновых протеиназ, в том числе факторов роста, а также матриксных металлопротеиназ, коллагеназ и др. [7; 12]. В обзоре E.I. Deryugina, J.P. Quigley [7] сообщалось, что плазмин необходим для активации практически всех матриксных металлопротеиназ, включая ММП-1, ММП-2, ММП-3, ММП-9, ММП-12, ММП-13 и ММП-14. Опосредованно этому способствуют активаторы плазминогена uPA и tPA, содержание и активность которых увеличивались практически во всех исследованных образцах ткани сравнительно с областью линии резекции (табл.).

Во многих сообщениях представлены данные по содержанию активаторов ПГ в ткани опухолей различной локализации, но не исследована перифокальная ткань, а, по нашим данным, эта область является промежуточной между опухолью и гистологически неизменённой тканью пищевода по содержанию целого ряда показателей. У мужчин с наличием метастазов таковыми являются обе формы PAI-1, uPA и tPA, у мужчин без метастазов – PAI-1-акт, uPA-акт, обе формы tPA, и свободный П (табл.).

Сравнительно с опухолью без mts, её перифокальная зона содержала uPA-АГ в 5,1 раза, а соответствующая зона опухоли с mts – в 5,6 раза меньше, причём образование uPA-акт было здесь более интенсивным, чем в аналогичной ткани вокруг опухоли без mts (табл.). Не исключено, что у всех обследованных больных клетки плоскоклеточного рака пищевода секретировали в окружающую среду uPA-АГ, активация которого затруднена в опухоли, давшей mts, но реализована в её перифокальной зоне.

Преобладание в перифокальной ткани всех больных свободного П и обеих форм tPA, сравнительно с опухолью, вызывает новые вопросы. Возможно, в опухоли плоскоклеточного рака пищевода и непосредственно окружающей её ткани при наличии mts и без них активация tPA и освобождение П опосредованы различными механизмами и/или происходило «уклонение» tPA и П из опухоли в перифокальную ткань, что особенно чётко видно в группе мужчин, имеющих mts. Можно также предположить, что низкое содержание tPA и П в опухоли при наличии mts связано с уменьшением содержания в ней фибрина в связи с перемещением очагов пролиферации к её периферии и в перифокальную область [1]. С tPA, который, в отличие от uPA, протеолитически активен в отношении фибрина (подобно плазмину), связан истинный фибринолиз, в том числе внесосудистый [13]. Фибриновые волокна всегда присутствуют в любой опухолевой ткани, это особенно характерно для зоны активной пролиферации малигнизированных клеток [1]. Увеличение обеих форм tPA и uPA-акт в перифокальной ткани опухолей всех мужчин объясняет высокое содержание здесь П и позволяет предполагать присутствие во внесосудистом пространстве этой области повышенного количества фибрина.

PAI-1 связывается с tPA и uPA прочной ковалентной связью, необратимо инактивируя их и опосредованно снижая количество образующегося П. Роль этого серпина в злокачественно трансформированной ткани, по-видимому, неоднозначна. Если в опухоли его количество было наибольшим при отсутствии mts, то в перифокальной ткани максимальное содержание наблюдали при наличии mts (табл.), причём количество PAI-1-акт превосходило таковое в опухолевых образцах обеих групп. В свете последних сообщений, резко повышенное содержание PAI-1 в исследованных опухолях пищевода и окружающей их ткани, установленное нами (табл.), скорее может служить подтверждением и маркером степени их агрессивности, чем показателем эндогенной защиты. Ранее мы регистрировали дисбаланс между тканевыми серпинами, а также серпинов с активаторами плазминогена при аденокарциноме толстой кишки [2;10].

В ткани пищевода по линии резекции опухоли с наличием mts количество uPA и PAI-1 на порядок ниже, чем в само́й опухоли, но количество uPA здесь выше, чем в области линии резекции опухоли, не давшей mts. Следует заметить, что данные по tPA и uPA в области линии резекции метастазирующей опухоли весьма сходны: регистрировалось достоверное увеличение сравнительно с тканью по линии резекции опухоли без mts (табл.). Повышенное содержание П, РАР и обоих активаторов ПГ в этой области указывает на то, что нельзя считать эту ткань здоровой даже условно, скорее, по состоянию белкового метаболизма, она может быть продолжением перитуморозной ткани, «готовящейся» к расширению «опухолевого поля», по крайней мере на молекулярном уровне. Полученные результаты согласуются с выводом А.В. Воробьева [1] о том, что злокачественно трансформированные клетки влияют на активность эндогенной фибринолитической системы.

Таким образом, мы считаем компоненты тканевой системы активации плазминогена важными участниками процесса метастазирования плоскоклеточного рака пищевода. Относительно tPA – возможно, было бы полезно усилить его протеолитическое действие в отношении фибрина, однако это требует дополнительных исследований. Например, L. Gong et al. [9] подтверждено, что инактивация tPA ингибитором PAI-1, хоть и происходит очень быстро, но всё же медленнее, чем uPA, к тому же авторами установлено, что процесс затрудняется влиянием мутировавших молекул в непосредственной близости опухоли, а это замедляет лизис внесосудистого фибрина. В настоящее время авторами осуществляется поиск варианта создания рекомбинантного tPA, устойчивого к инактивации эндогенным и/или опухолевым PAI-1. При плоскоклеточном раке пищевода П, uPA и PAI-1 могут стать мишенями направленного действия антиметастатических препаратов. Для оценки перспективности их использования в клинической практике необходимо в каждом конкретном случае устанавливать нозологический вид опухоли и выявлять группы больных, у которых эффект будет наилучшим. Однако недостаточно определить морфологическую принадлежность опухоли, нужны биохимические тесты, определяющие особенности метаболических изменений всего опухолевого региона, в частности перитуморальной зоны и области линии резекции. Возможно, при одинаковой стадии развития и степени зрелости злокачественной опухоли, рассмотренной нами (st II, G2, T_2-3N₀M₀ и st II, G2, T_2-3N_1-2M₀), опухоль T_2-3N_1-2M₀ имеет иную биологическую природу, поскольку ей присуща бо́льшая агрессивность, несмотря на морфологическую идентичность с опухолью T_2-3N₀M₀.

Выводы

1. Сериновые протеиназы плазмин, uPA и ингибитор PAI-1 являются метаболитами опухоли плоскоклеточного рака пищевода как при наличии mts в лимфоузлы, так и при их отсутствии.
2. Максимальные количества PAI-1 содержатся в опухоли плоскоклеточного рака пищевода при отсутствии mts, в перифокальной зоне – при их наличии.
3. Протромбокиназа не активируется в туморозном очаге плоскоклеточного рака пищевода, находясь в нём в основном в виде tPA-АГ, причём при наличии mts в лимфоузлы её количество на грани истощения.