Известно, что клещевой энцефалит (КЭ) является одной из наиболее распространенных природно-очаговых инфекций, сопровождающихся развитием как бессимптомных (инаппарантных) и относительно благоприятно протекающих лихорадочных форм (ЛФ), так и более тяжелых - менингеальных (МФ) и в особенности очаговых форм (ОФ). Установлено, что многие вирусные и бактериальные инфекционные заболевания, включая КЭ, сопровождаются индукцией повреждений ДНК и цитогенетическими нарушениями в различных типах соматических клеток [1]. Одним из основных механизмов, приводящих к интенсификации мутационных изменений ДНК при инфекционном процессе, считается окислительный стресс, инициируемый провоспалительными цитокинами [2]. Установлено, что тяжесть течения КЭ и развитие наиболее тяжелой ОФ болезни тесно связаны с активностью иммунопатологических и окислительных процессов [3]. Известно, что КЭ у большинства инфицированных людей протекает в бессимптомной инаппарантной форме болезни, однако в настоящее время отсутствуют какие-либо критерии, позволяющие прогнозировать риск манифестного течения заболевания у лиц с острой антигенемией (ОА) в инкубационный период после присасывания клеща. К числу наиболее трудных проблем диагностики КЭ относится раннее распознавание ОФ, которую в начале заболевания сложно дифференцировать от МФ. Потенциально для этих целей можно использовать показатели оценки активности окислительного стресса (ОС), продукции цитокинов лимфоцитами крови и микроядерного теста, как одного из наиболее технически простых методов изучения частоты клеток с цитогенетическими нарушениями [4]. Одним из современных направлений диагностики некоторых тяжело протекающих инфекционных заболеваний является разработка компьютерных диагностических алгоритмов и шкал, которые могли бы использоваться для определения тяжести и прогнозирования исходов заболевания [5]. Целью данной работы было выявить прогностические критерии и составить диагностические алгоритмы, позволяющие дифференцировать ОФ и МФ КЭ, а также ОА и ЛФ этого заболевания на основе оценки некоторых иммунологических (продукции цитокинов лимфоцитами), цитопатологических показателей (частоты выявления микроядер (МЯ) в различных типах клеток) и одного из основных параметров активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - определения концентрации малонового диальдегида (МДА).

Материал и методы

Работа выполнена на базах клиники инфекционных заболеваний Сибирского государственного медицинского университета (СибГМУ) и инфекционного отделения ОГАУЗ 3-й Городской больницы г. Томска в период эпидсезонов КЭ 2009-2016 годов. В исследование было включено 27 лиц с ОА после присасывания клеща, у которых в дальнейшем не развилась манифестная форма заболевания, 22 пациентов с диагнозом ЛФ, 23 больных с МФ и 15 больных ОФ острого КЭ, а также 22 здоровых лица в качестве контроля. Все группы были сопоставимы по полу и возрасту, который варьировал от 18 до 62 лет. Среди больных ОФ преобладали больные менингоэнцефалитическим вариантом.

Диагноз был верифицирован обнаружением IgM и IgG к вирусу КЭ методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Кольцово, Россия). Исследование было одобрено Этическим комитетом СибГМУ Минздрава РФ (протокол № 4308 от 19.10.2015 г.) и проводилось только после получения информированного согласия на участие в соответствии с правилами «О порядке проведения биомедицинских исследований у человека» (2002) и «Правилами клинической практики» (Приказ МЗ РФ № 266 от 19.06.03).

Оценку активности реакций ПОЛ проводили по содержанию МДА в сыворотке крови в реакции с тиобарбитуровой кислотой [6]. У всех обследованных лиц был проведен анализ частоты клеток буккального эпителия (БЭ) с МЯ в цитологических мазках, фиксированных в абсолютном этаноле [4]. Для изучения частоты бинуклеарных цитокинез-блокированных Т-лимфоцитов периферической крови с МЯ получали культуры этих клеток в соответствии со стандартной методикой [4]. Использовали питательную среду RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma-Aldrich, США) и фитогемагглютинина (ФГА) как стимулятора деления (10 мкг/мл) («ПанЭко», Россия). После 44 ч культивирования при 37 °С в культуру клеток добавляли цитокинез-блокирующий агент - цитохалазин В (Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации 6 мкг/мл. Фиксацию клеток в смеси метанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) и приготовление препаратов начинали через 72 ч после начала инкубации. Препараты БЭ и лимфоцитов окрашивали по методу Романовского-Гимзе и анализировали не менее 1000 клеток у каждого человека.

Кроме того, мы оценили спонтанные уровни продукции интерферонов-альфа и -гамма (ИФ-α, ИФ-γ), фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-a) и интерлейкинов-4 и -10 (ИЛ-4 и ИЛ-10) в супернатантах 24-х часовых культур мононуклеарных клеток с помощью твердофазного ИФА в соответствии с инструкциями, предлагаемыми производителем тест-систем (ООО «Протеиновый контур», Россия).

Различия качественных данных между группами были проанализированы с помощью определения показателя отношения шансов (ОШ), критерия значимости гипотезы χ² или точного критерия Фишера. Зависимости между переменными определяли с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Для обработки данных и статистического анализа применялись модули приложения Scorecard программного обеспечения STATISTICA 12.0 (StatSoft, США) [7], предназначенные для разработки и оценки моделей оценочных алгоритмов. Вначале с помощью модуля, определяющего информационную ценность каждого показателя, была дана оценка их прогностической силы, затем был использован бинарный логистический регрессионный анализ и сгенерирована шкала в баллах для каждой модели [7]. Прогностическая оценка диагностической модели проведена с помощью ROC-анализа (receiver operating characteristic) в координатах графиков «чувствительность–специфичность» с вычислением AUC (area under ROC curve) – площади под ROC-кривой и COV (cut-off value) – значения оптимального порога отсечения переменной [8]. При проверке статистических гипотез значения Р<0,05 считались как статистически значимые. Данные были представлены как медиана (Mе) и квартили [Q₂₅ ; Q₇₅].

Результаты и обсуждение

Установлено, что секреция ИФ-a и ИФ-g в супернатантах культур лимфоцитов больных ЛФ (35,3[32,0;44,8] и 19,3[12,3;33,4] пг/мл), МФ (25,3 [14,4;32,8] и 16,2 [12,4;25,6] пг/мл) и ОФ (15,3[13,4;25,3] и 14,2[10,8;16,0] пг/мл) была существенно выше, чем в контрольной группе (3,1[2,2;5,7] и 6,9[5,5;8,4] пг/мл, P<0,001 во всех случаях). Аналогичные достоверные изменения были выявлены в отношении продукции ФНО-a и соотношения ФНО-a/ИЛ-4 у больных ЛФ (18,3[13,9;22,2] пг/мл и 6,1[2,7;9,5]), МФ (39,1[15,9;48,3] пг/мл и 7,9[6,8;13,5]) и в особенности у пациентов с ОФ (56,5 [45,9;58,8] пг/мл и 14,2[2,9;11,2]), по сравнению с контролем (5,0 [3,8;6,9] пг/мл и 2,4[1,4;3,3], P<0,001 во всех случаях), что свидетельствовало о поляризации иммунного ответа по пути Т-хелперов (Th) типа 1 и совпадало с данными других авторов [9]. Известно, что ФНО-a активирует ОС и, так же как и МДА, может характеризовать степень эндогенной интоксикации [2], о чем также свидетельствует прямая корреляционная связь между продукцией ФНО-a и/или соотношением ФНО-a/ИЛ-4 и содержанием МДА в сыворотке крови больных КЭ (r=0,45 и r=0,56, P=0,005 и P<0,001). Более того, у больных с МФ и ОФ концентрация МДА в сыворотке крови (4,3[3,5;6,6] и 7,3[6,1;8,5] мкмоль/л), а также частота выявления клеток БЭ с МЯ (4,7[3,2;6,6] и 10,6[7,8;12,4] %) и частота лимфоцитов с МЯ (5,6[4,7;7,5] и 11,5[10,9;21,8] %) были значительно выше не только, чем в контроле (1,0[0,5;1,7] мкмоль/л, 0,3[0,2;0,4] % и 0,4[0,2;0,6] %, при P<0,001 во всех случаях), но и по сравнению с пациентами с ЛФ (2,6[2,2;4,1] мкмоль/л, 2,67[2,3;3,3] % и 3,2[2,3;4,5] %, P<0,001, P<0,001 и P=0,021 соответственно). У больных КЭ также выявлена прямая корреляционная зависимость между частотой клеток БЭ с МЯ, лимфоцитов с МЯ и концентрацией МДА в сыворотке и/или продукцией ФНО-a (r=0,69, r=0,62 и r=0,58, r=0,49, P<0,001), что свидетельствовало о тесной взаимосвязи ОС и повреждения ДНК.

Однако в супернатантах больных МФ и в особенности ОФ продукция ИФ-a и ИФ-g оказалась значительно ниже, чем у больных ЛФ (P=0,001 и P<0,001 для ИФ-a и P=0,038 и P=0,011 для ИФ-g), что может быть связано со снижением функциональной активности Т-клеток. Кроме того, у больных ОФ продукция ИЛ-10 в супернатантах культур (33,6[25,0;37,1]) была существенно выше, чем у больных ЛФ (17,0[12,4;29,3], P=0,039), что, по-видимому, отражает направленность этого цитокина на ограничение воспалительной реакции у пациентов ОФ КЭ [9].

В таблице 1 проанализированы результаты изучения показателя отношения шансов (ОШ) для различных параметров ОС, цитокинового статуса и микроядерного анализа, которые показывают во сколько раз шанс иметь изучаемый признак в группе больных ОФ больше, чем в группе с МФ КЭ.

Таблица 1

Малоновый диальдегид в сыворотке крови, а также некоторые иммунологические и цитогенетические показатели как предикторы очаговой формы клещевого энцефалита

Примечание: КЭ - клещевой энцефалит; МФ - менингеальная форма; ОФ - очаговая форма; ИФ – интерферон; ИЛ – интерлейкин; ФНО – фактор некроза опухоли; МЯ – микроядро; ОШ - отношение шансов; 95% ДИ - 95% доверительный интервал; χ² - критерий значимости гипотезы; ТФК – точный критерий Фишера; Р - значимость различий.

Установлено, что высокое прогностическое значение для диагноза ОФ КЭ продемонстрировали значения показателей МДА выше 6,0 мкмоль/л, ИФ-a ниже 20,0 пг/мл, ИФ-g ниже 15,0 пг/мл, ИЛ-10 выше 28,0 пг/мл, ФНО-a выше 43,0 пг/мл, соотношения ФНО-a/ИЛ-4 больше 11,0, частоты клеток БЭ с МЯ более 6% и частоты лимфоцитов с МЯ более 9%.

В таблице 2 приведены результаты ROC-анализа и определения AUC и COV с оценкой чувствительности и специфичности изученных показателей в качестве предикторов ОФ или МФ КЭ, а также ЛФ или ОА. Установлено, что «очень хорошее» качество прогноза высокого риска развития ОФ имели концентрация МДА в сыворотке крови, продукция ИЛ-10, ФНО-a, соотношение ФНО-a/ИЛ-4, частота клеток БЭ с МЯ и частота лимфоцитов с МЯ.

Таблица 2

Чувствительность и специфичность иммунологических и цитогенетических предикторов для дифференциальной диагностики очаговой и менингеальной форм, а также острой антигенемии и лихорадочной формы клещевого энцефалита

Примечание: ОА - острая антигенемия вируса клещевого энцефалита; ЛФ – лихорадочная форма; ROC-анализ (receiver operating characteristic) - приемная характеристика приемника; AUC (area under ROC curve) – площадь под ROC-кривой; COV (cut-off value) – значение оптимального порога отсечения.

Цитокиновый статус лиц с ОА отличался от контроля умеренным увеличением концентраций ИЛ-4 (3,6[2,6;5,1] против 2,5[1,7;2,9] пг/мл, P<0,001) и ИЛ-10 (15,7 [11,3;23,2] против 9,4 [7,1;15,0] пг/мл, P=0,017). Продукция ИФ-a (14,9[13,1;20,4]) и ИФ-g (9,2[6,2;15,1]) у лиц с ОА оказалась статистически значимо выше, чем в контрольной группе (3,1[2,1;5,7] пг/мл, P<0,001 и 6,9 [5,5;8,4] пг/мл, P=0,039), но существенно ниже по сравнению с больными ЛФ (P<0,001), что соответствовало данным других авторов [10]. К числу предикторов высокого риска ЛФ КЭ после укуса клеща и дифференцирования ЛФ и ОА (табл. 2) можно отнести значения показателей ИФ-a выше 23 пг/мл (χ² =17,4, P<0,001), ИФ-g выше 12,6 пг/мл (χ² =8,5, P=0,003) и ИЛ-4 ниже 3,9 пг/мл (χ² =4,1, P=0,044).

В таблице 3 приведены результаты логистического регрессионного анализа параметров у больных МФ и ОФ КЭ. Установлено, что модель имеет «отличное» качество прогноза диагноза ОФ (AUC = 0,95, при стандартной ошибке среднего (S) ±0,04). Для каждого показателя в таблице приведены коэффициенты регрессии (B) и указана условная шкала, которая позволяет рассчитать сумму баллов для каждого пациента. При сумме баллов 454 вероятность развития ОФ 78,0%, а вероятность МФ только 4,4%. В случае суммы баллов 388 и ниже вероятность МФ равна нулю, а ОФ – 55,6%, а при сумме баллов 558 и выше вероятность ОФ равна нулю, а МФ – 52,2%.

Таблица 3

Иммуноцитопатологические алгоритмы прогноза очаговой формы клещевого энцефалита

Примечание: B – коэффициент регрессии; 95% ДИ - 95% доверительный интервал; χ² – критерий «хи-квадрат»; Р - значимость различий.

Заключение

Таким образом, показана тесная взаимосвязь между активацией ОС, продукцией провоспалительных цитокинов и индукцией цитогенетических нарушений у больных КЭ. Кроме того, продемонстрирована возможность прогнозирования риска развития ОФ у больных КЭ, а также риска манифестного течения ЛФ в первые дни после присасывания клеща благодаря использованию иммуноцитогенетических критериев и регрессионной модели.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 16-40-700149.