Одним из гормонов, принимающих участие в регуляции физиологического равновесия между клеточным и гуморальным звеньями адаптивного иммунного ответа, является хорионический гонадотропин. Он выделяется ворсинчатым хорионом, и в зависимости от стадии развития плаценты его концентрация в крови и моче беременной изменяется, нарастая со сроком беременности [1]. Кроме того, этот гормон обладает выраженным действием на организм и в отсутствие беременности, в частности изменяет морфологию тимуса и распределение в нем иммунокомпетентных клеток [2]. При этом претерпевает изменение адренергическая иннервация тимуса, содержание катехоловых аминов в тучных клетках и нервных волокнах зависит от сроков поступления хорионического гонадотропина в организм небеременных мышей. Катехоловые амины являются теми сигнальными молекулами, действие которых сходно для человека и животных в процессах онтогенеза нейроэндокринной и иммунной систем [3]. Еще одним биогенным амином, принимающим участие в нейроиммуноэндокринных взаимодействиях, является серотонин, подтипы рецепторов которого широко представлены на иммунокомпетентных клетках [4]. В связи с этим интересно проследить наличие связей между содержанием катехоловых аминов и серотонина в одних и тех же тимусных структурах при поступлении в организм хорионического гонадотропина.

Целью нашей работы явилось изучение серотонинсодержащих структур тимуса мышей при введении хорионического гонадотропина в зависимости от сроков поступления.

Материал и методы исследования

Серотонин выявляли в тимусе 100 самок белых нелинейных мышей в отсутствие беременности, мыши содержались в условиях вивария, при естественном освещении, на стандартном сбалансированном рационе со свободным доступом к воде и корму. Были сформированы несколько экспериментальных групп: I – интактная (n=20) – мыши, не подвергавшиеся воздействию; II – контрольная – мыши, получавшие дважды в неделю 0,02 мл физиологического раствора (Люблинский фармацевтический завод, Польша) внутримышечно (II А – одну неделю (n=10), II Б – две недели (n=10); II В – три недели (n=10); II Г – четыре недели (n=10)); III – подопытная – мыши, получавшие инъекции раствора хорионического гонадотропина (ФГУП «Московский эндокринологический завод», Россия) по 2 Международные единицы (МЕ)/мышь дважды в неделю (III А – одна неделя (n=10); III Б – две недели (n=10); III В – три недели (n=10); III Г – четыре недели (n=10)). Дозировка гормона рассчитывалась таким образом, чтобы в зависимости от веса мышей она была эквивалентна 500 МЕ (той дозировке, которая применяется в клинической практике).

Тимус извлекали непосредственно после декапитации, орган замораживали, готовили криостатные срезы для постановки люминесцентно-гистохимических реакций.

Для выявления серотонина в содержащих его структурах нами был выбран люминесцентно-гистохимический метод Фалька–Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной, хорошо зарекомендовавший себя в комплексных исследованиях при изучении лимфоидных органов [5].

Суть этого метода заключается в том, что после пребывания свежих криостатных срезов, высушенных на воздухе, в парах формальдегида, выдержанного в термостате при температуре 80оС в течение 1 часа, серотонин, содержащийся в тканях, преобразуется в карболины, которые флуоресцируют в зависимости от количественного содержания серотонина разными оттенками желтого. Для идентификации и количественного выражения содержания серотонина в структурах тимуса использовали метод цитоспектрофлуориметрии. На люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-4А (ЛОМО, СССР) устанавливали дополнительную насадку ФМЭЛ-1А (ЛОМО, СССР) с выходным напряжением 900 В, использовали светофильтр № 8 с длиной волны 360 нм. Показания снимали с табло усилителя У-5 в условных единицах флуоресценции (милливольты).

Для того чтобы морфологические выборки люминесцирующих структур были репрезентативными, их производили случайным отбором, в каждом срезе измеряли интенсивность люминесценции в клетках, нервных терминалях и в их микроокружении в пяти случайных полях зрения, в 20 клетках на каждое поле зрения, затем вычисляли среднее арифметическое значение интенсивности люминесценции серотонина по каждой структуре для каждой морфофункциональной зоны как по отдельно взятой мыши, так и в группе; для всех средних рассчитывалась стандартная ошибка среднего значения (m). При обработке цифрового массива и проведении анализа различий между реакциями структур мышей, получавших и не получавших хорионический гонадотропин, проводили проверку вариационных рядов на нормальность распределения. Если гипотеза о нормальности распределения не подтверждалась, использовали непараметрические критерии Вилкоксона–Манна–Уитни; если подтверждалась, то статистическую значимость различий средних величин рассчитывали с помощью программы Microsoft Office Excel через статистические методы ТТЕСТ, при установке хвосты = 2 (использовалось двустороннее распределение), тип = 3 (для неравных отклонений). Различия считали статистически значимыми при значениях p ≤ 0,05. Далее в тексте значимость различий обозначается так: * – различия с контрольной группой, p < 0,05; ** – различия с контрольной группой, p < 0,001; ри – различия с интактной группой, p < 0,05 и p < 0,001. Средние значения (M) приводятся со стандартной ошибкой среднего значения (m).

Результаты исследования и обсуждение

Люминесцентная гистохимия позволяет выявить в тимусе мышей определенным образом расположенные люминесцирующие гранулосодержащие клетки (ЛГК), это расположение определяет морфофункциональные зоны: корковое и мозговое вещество долек тимуса. В корковом веществе долек тимуса ЛГК располагаются диффузно, их максимальная концентрация наблюдается на участках, прилежащих к междольковым корковым перегородкам. У интактных мышей и мышей, получавших физиологический раствор на разных сроках эксперимента, граница между корковым и мозговым веществом долек тимуса представлена одним рядом близко расположенных ЛГК, которые образуют своего рода границу (см. рисунок). ЛГК характеризуются наличием люминесцирующих гранул светлых оттенков желтого цвета, различных по величине и интенсивности свечения. В микроокружении ЛГК наблюдается зона диффузного свечения, причем визуально эта зона более выражена в ЛГК коркового вещества долек тимуса. Среди ЛГК тимуса можно выделить клетки с характерными равномерно расположенными округлыми субтильными гранулами, которые согласно морфологическим характеристикам можно отнести к тучным клеткам. Близко от них обнаруживаются терминальные окончания нервных волокон, имеющих зеленоватый оттенок.

Тимус интактной мыши. Люминесцирующие гранулосодержащие клетки на границе между корковым и мозговым веществом дольки. Слева от полуовальной зоны – корковое вещество, справа – мозговое вещество. Метод Фалька–Хилларпа. Микроскоп ЛЮМАМ-4А. Ув. х400

Поступление хорионического гонадотропина изменяет люминесцентную морфологию тимуса, что выражается в изменении количества клеток на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса, появлении второго слоя люминесцирующей зоны. Одновременно с этим корковое вещество долек тимуса начинает визуализироваться более ярко, а ЛГК, напротив, теряют свою яркость, отдельные гранулы в них становятся неразличимы. Визуальная картина полностью подтверждается результатами проведенной цитоспектрофлуориметрии, выявившей снижение интенсивности люминесценции серотонина в структурах исследуемого органа (табл. 1,2).

Данные таблиц показывают, что интенсивность люминесценции серотонина в клетках и нервных терминалях долек тимуса мышей не зависит от введения физиологического раствора на всех сроках эксперимента, в то время как введение хорионического гонадотропина заметно меняет содержание серотонина в этих структурах по сравнению с интактной группой животных. Обращает на себя внимание тот факт, что изначальная концентрация серотонина в нервных терминалях долек тимуса существенно ниже концентрации его в клетках и их микроокружении, что наводит на мысль о том, что нервные терминали, вероятно, не играют ведущей роли в снабжении серотонином лимфоцитов, находящихся в микроокружении ЛГК. Эта мысль подкрепляется нашими предыдущими исследованиями, касающимися тучных клеток при введении хорионического гонадотропина.

Таблица 1

Интенсивность люминесценции серотонина в структурах тимуса мышей интактной, контрольных и опытных групп, в усл. ед., х102 (M±m)

* – различия с контрольной группой статистически значимы, Ри < 0,05;

** – различия с контрольной группой статистически значимы, Ри < 0,001;

Ри – различия с интактной группой статистически значимы, Ри < 0,05 и Ри < 0,001.

Интересно сопоставить интенсивность люминесценции серотонина с данными, касающимися пролиферативной активности лимфоцитов в корковом и мозговом веществе долек тимуса на этих же сроках введения гонадотропина, представленной нами в предыдущих работах [6]. Так, по сравнению с интактными животными на первой неделе среднее количество клеток, экспрессирующих маркер пролиферации Ki-67, увеличивается в 1,5 раза как в корковом, так и в мозговом веществе долек тимуса, и этот пик совпадает с минимальной интенсивностью люминесценции серотонина в его клетках.

Таблица 2

Интенсивность люминесценции серотонина в структурах тимуса мышей интактной, контрольных и опытных групп, в усл. ед., х102 (M±m)

* – различия с контрольной группой статистически значимы, p < 0,05;

** – различия с контрольной группой статистически значимы, p < 0,001;

ри – различия с интактной группой статистически значимы, p < 0,05 и p < 0,001.

В течение последующих трех недель количество Ki-67 экспрессирующих клеток постепенно снижается пропорционально сроку воздействия, достигая к четырем неделям половинных показателей по сравнению с животными интактной группы. Согласно литературным данным производные аминокислот (такие как гистамин, серотонин, адреналин) стимулируют фагоцитоз у многоклеточных животных, в то время как хорионический гонадотропин оказывает отрицательное влияние на этот процесс [6]. Можно предположить, что увеличение пролиферативной активности лимфоцитов связано с уменьшением захвата лимфоцитов макрофагами тимуса, к которым и относятся люминесцирующие гранулярные клетки коркового вещества долек тимуса. Итак, первую неделю поступления в организм хорионического гонадотропина можно считать временем проявления всех его эффектов, в том числе и снижения фагоцитарной активности макрофагов в тимусе, которая впоследствии не только «выправляется», но и сменяется на противоположную. Имеются сообщения, что серотонин и белок Кi67 могут быть маркерами одних и тех же процессов, например нейроэндокринных бронхопульмональных и тимических опухолей [7].

Начиная со второй недели в корковом веществе долек тимуса пропорционально сроку воздействия начинает возрастать количество клеток, содержащих маркер апоптоза р-53. Примечательно, что результаты по изменению интенсивности серотонина очень сходны с таковыми, касающимися катехоловых аминов при воздействии на организм хорионического гонадотропина, при этом максимальные пики снижения интенсивности люминесценции наблюдаются на первой и третьей неделе воздействия. Изменения, касающиеся катехоловых аминов и серотонина в структурах тимуса под воздействием хорионического гонадотропина, сходны. Это можно объяснить тем, что в условиях беременности выделяемый плацентой гормон с ранних сроков способен снижать в материнском организме стресс, медиаторами которого, помимо кортизола, являются катехоловые амины, серотонин, цитокины и микрофлора материнского организма [8]. Получается, что серотониновая система чувствительна к поступлению хорионического гонадотропина, и она принимает участие в обеспечении тонких настроек адаптации организма.

Таким образом, проведенное нами исследование показывает, что при поступлении в организм мышей хорионический гонадотропин способен изменять концентрацию серотонина в структурах тимуса; это дает основание предположить, что гормон задействует серотонинзависимые процессы для иммуномодуляции и снижения возможных проявлений стресса на организм самок во время беременности.