Мы живем в стареющем обществе. В современной медицине важное место занимает лечение лиц престарелого возраста. Нарушения работы иммунной системы считаются одной из основных причин старения. В динамике старения возможно нарушение работы как иммунной системы в целом, так и отдельных ее компонентов и механизмов. Их выявление представляется особенно важным при использовании дополнительных экзогенных антигенных воздействий, к которым относится введение ботулотоксина типа А для коррекции гипермимических морщин [1]. Следует учитывать, что это может оказывать влияние и на качество жизни людей зрелого возраста [2].

Взаимосвязь различных патологических процессов с нарушениями иммунологической реактивности позволила сделать вывод, что старение иммунной системы уменьшает продолжительность жизни [3]. При этом ослабление функциональной активности иммунитета с возрастом может быть обусловлено как изменениями самих иммунокомпетентных клеток, так и изменениями клеточного окружения, нейрогормонального равновесия [4].

Согласно результатам проведенного иммунологического обследования [5] было выявлено, что в возрасте от 60 до 74 лет происходит резкое снижение защитных возможностей врожденного иммунитета.

Изменения реактивности неспецифического клеточного и антигенспецифического иммунного ответа у пожилых пациентов носят разнонаправленный характер. Наиболее показательными данными, подтверждающими данный аргумент, являются: снижение СD 3+, CD4+ T-лимфоцитов; как снижение, так и повышение общей гемолитической активности комплемента; уменьшение метаболической активности клеточных факторов неспецифической резистентности, а кроме того, увеличение СРБ [6].

Цель исследования: проанализировать изменение клеточных показателей иммунного статуса в зависимости от возраста пациенток и оценить возможное влияние на них ботулотоксина типа А (БТА), применяемого для коррекции гипермимических морщин.

Материал и методы исследования. При выполнении работы было проведено клинико-лабораторное обследование 200 пациенток разного возраста, обратившихся для коррекции возрастных изменений кожи лица в клиническую базу ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России ООО «Профессорская клиника Юцковских» с 2011 по 2015 годы. Исследование проведено в два этапа. На I этапе ретроспективно была проведена оценка 300 амбулаторных карт пациенток, получавших коррекцию гипермимических морщин препаратом ботулотоксина типа А. Оценены клиническая эффективность (по времени наступления эффекта и удовлетворенности пациентки), наличие и характер побочных эффектов. На II этапе – наблюдательном, сравнительном, проспективном – было обследовано 200 пациенток трех возрастных групп, которые были разделены на 2 равные группы: в первой группе женщины (n=100 человек) получали лечение гипермимических морщин препаратом ботулотоксина типа А в дозе от 100 до 150 ед. Во второй группе – группе сравнения – эта терапия не проводилась. В качестве материала для иммунологических исследований применялась цельная кровь. Проведены иммунофенотипирование основных иммунокомпетентных клеток с анализом основных эффекторных клеток – Т-лимфоцитов (CD3⁺CD19^-), В-лимфоцитов (CD19⁺CD3^-), NK-клеток (CD3^-CD16⁺CD56⁺), оценка основных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4⁺CD3⁺, CD 19^-, CD8⁺) и маркеров позитивной (CD25⁺, HLA-DR⁺) и негативной (CD95⁺) активации иммунокомпетентных клеток и Т-лимфоцитов (CD3⁺ CD25⁺, CD3⁺HLA-DR⁺, CD3⁺CD95⁺), исследована также минорная популяция лимфоцитов, относящихся к нормальным Т-клеткам-киллерам (CD3⁺CD16⁺ CD56⁺) в трех возрастных группах: молодого, среднего и пожилого возраста, распределенных в зависимости от способа коррекции гипермимических морщин: с применением ботулотоксина типа А или нет. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии (цитофлуориметр FACScan, Becton Dickinson) с использованием моноклональных антител к кластерам дифференцировки (Claster of Differentiation – CD) с двойной меткой (Bekman Coulter, Франция), рассчитывая удельный вес клеток (%) и их абсолютное содержание в единице объема крови. Математическая обработка показателей проведена методами описательной вариационной статистики с использованием программ «Statistica-10», «R» и «SPSS® v.16.», «MedCalc». Для определения направления и формы связи между признаками, измерения ее степени и оценки статистической значимости использовали методы корреляционного анализа: коэффициент ранговой корреляции Спирмена, критерий χ2.

Результаты исследования и обсуждение. Анализ результатов иммунофенотипирования основных иммунокомпетентных клеток показал, что у женщин пожилого возраста снижен удельный вес лимфоцитов по сравнению с пациентками молодого возраста (р<0,05, табл. 1), однако их абсолютное количество отличалось незначительно (р>0,05). При анализе экспрессии основных дифференцировочных маркеров лимфоцитов и их субпопуляций выявлено, что у женщин пожилого возраста статистически достоверно снижен удельный вес Т-лимфоцитов (CD3⁺CD19^-) за счет уменьшения доли CD3⁺CD4⁺Т-клеток хелперов.

Таблица 1

Характеристика основных популяций лимфоцитов у обследованных пациенток основной и контрольной групп в зависимости возраста

Примечание: статистическая достоверность различий между исследуемыми группами: р _1,2,3,4,5,6.

Молекула CD3⁺ – это главный маркер зрелых Т-клеток, она состоит из трех полипептидных цепей – γ, δ и ε. Молекула CD3 – это часть Т-клеточного рецептора (ТСR), распознающего антиген. Молекула CD4 является корецептороной структурой ТСR, экспрессируется на Т-хелперах и участвует в распознавании антигена совместно со структурами МНС II. При этом их снижение определено в обеих включенных в исследование группах женщин пожилого возраста (р<0,05–0,01).

Для реализации антигенспецифической цитотоксичности в организме дифференцирована субпопуляция Т-клеток-киллеров или цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺CD19^-). Ключевая роль этих клеток – это защита от видоизмененных и инфицированных собственных клеток. Не установлено существенных различий удельного веса и абсолютного количества CD8⁺ Т-цитотоксических лимфоцитов в зависимости от возраста (табл. 1). Можно согласиться с авторами, которые считают, что при старении развивается иммунодефицит по Т-системе с преимущественным снижением Т-хелперов [7]. Однако нами не выявлено статистически значимого нарушения иммунорегуляторного индекса у пациенток пожилого возраста, следует только отметить тенденцию к его уменьшению в III возрастной группе (р<0,1). Это в целом отражает удовлетворительную количественную характеристику Т-клеточного иммунного ответа у женщин, в том числе пожилого возраста.

Нами не установлено существенных возрастных изменений CD3^-CD19⁺ В-лимфоцитов у женщин молодого и среднего возраста (табл. 1). Это согласуется с мнением большинства исследователей [1]. Но в группе женщин пожилого возраста определено статистически значимое увеличение удельного веса В-клеток, тогда как их абсолютное содержание не отличалось в других исследованных группах (табл. 1).

При оценке содержания CD3^- CD16⁺ CD56⁺ (NК-клеток) не было выявлено существенных различий их удельного веса и абсолютного количества в анализируемых группах (табл. 1). В то же время зарегистрировано статистически значимое (р<0,05–0,01) увеличение у женщин пожилого возраста минорной популяции лимфоцитов, одновременно экспрессирующих рецепторы Т-лимфоцитов (CD3⁺) и CD16⁺ CD56⁺-структуры натуральных киллеров и относящихся к клеткам натуральным Т-клеткам-киллерам (табл. 1). Учитывая функциональную роль этих клеток, считаем, что их накопление в крови у людей старше 60 лет имеет адаптивную роль в обеспечении противоопухолевого иммунного ответа в первую очередь.

Анализ экспрессии активационных молекул на иммунокомпетентных клетках и Т-лимфоцитах позволил выявить ряд закономерностей: у женщин пожилого возраста обеих сравниваемых групп выявлено увеличение доли иммунокомпетентных клеток, экспрессирующих CD25 – маркер их ранней активации (табл. 1). При этом возрастало абсолютное число Т-лимфоцитов, несущих рецептор к ИЛ-2 (CD3+ CD25+). Так как этот маркер характерен и для Т-регуляторных клеток, нельзя отрицать вероятность увеличения у пожилых людей числа естественных супрессорных клеток (Т-регуляторных лимфоцитов), в то время как экспрессия маркера поздней позитивной активации была снижена как на всех иммуноцитах, так и на зрелых Т-лимфоцитах у пациенток пожилого возраста. Это свидетельствует о нарушении процессов переключения активации клеток с ранней на позднюю, что может явиться причиной их функционального дефекта.

Оценка доли числа клеток, экспрессирующих CD95 рецептор (маркер готовности к апоптозу), позволила выявить нарушения только в группе женщин пожилого возраста (табл. 1). Они касались доли зрелых Т-лимфоцитов (CD3+CD95+) с маркером поздней негативной активации. Полученные результаты позволяют объяснить механизм выявленного дефицита CD3+CD4+ – Т-хелперов, которые значительно более чувствительны к апоптозу, у этой категории обследованных. Корреляционный анализ позволил выявить сильную прямую связь между содержанием CD4 и CD25 антигенов на CD3+-лимфоцитах (r=0,72; р<0,05) и обратную среднюю связь между содержанием HLA-DR+ на   CD3+-клетках (r=0,5; р<0,05), что подтверждает дефект процессов активации Т-клеточного иммунитета в пожилом возрасте.

Итак, при анализе показателей, характеризующих структуру основных популяций и субпопуляций лимфоцитов периферической крови пациенток в зависимости от возраста, у пациенток старше 60 лет выявлено снижение общего числа Т-лимфоцитов, которое обусловлено дефицитом CD3+CD4+ Т-клеток-хелперов. При этом установлены признаки хронической Т-клеточной активации с нарушением переключения этих процессов с ранней на позднюю и усилии экспрессии маркера готовности к апоптозу (CD3+CD95+) у этой категории пациенток.

Результаты иммунофенотипирования основных лимфоцитов и экспрессии на них активационных маркеров у женщин разных возрастных групп, получавших коррекцию гипермимических морщин, через неделю и через 28 дней после инъекции БТА представлены в таблице 2. Проведенный анализ не позволил выявить статистически значимого влияния инъекций БТА на показатели иммунного статуса. В группе женщин пожилого возраста как до введения БТА, так и в динамике после его введения определено снижение удельного веса лимфоцитов, СД3⁺СД19^-, СД3⁺СД4⁺СД19^-, увеличение СД3⁺СД16⁺СД56⁺, а также сохранялось нарушение процессов активации иммунокомпетентных клеток (табл. 2).

Таблица 2

Результаты иммунофенотипирования лимфоцитов крови у пациенток, получавших ботулотоксин типа А для коррекции гипермимических морщин, в динамике

Примечание: статистическая значимость различий между исследуемыми группами р_1,2,3,4,5,6 и периодом до введения БТА не установлена.

Таким образом, динамический анализ основных маркеров иммунокомпетентных клеток показал отсутствие влияния применяемых для коррекции гипермимических морщин доз БТА у женщин всех трех возрастных групп.

Выводы. Таким образом, подводя итог данным, полученным при решении вопроса о состоянии основных показателей иммунного статуса у женщин разных возрастных периодов с оценкой возможного влияния БТА, применяемого с целью коррекции гипермимических морщин, можно констатировать, что у женщин пожилого возраста определяются увеличение удельного веса В-лимфоцитов и снижение Т-клеток с дефицитом Т-хелперов, обусловленным усилением готовности Т-лимфоцитов к апоптозу, нарушением процессов позитивной активации лимфоцитов, и компенсаторное увеличение NКТ-лимфоцитов.

Не выявлено количественных нарушений показателей фагоцитоза и функциональной активности В-лимфоцитов по уровню иммуноглобулинов основных классов у этой категории женщин. Применение БТА в дозе от 100 до 150 ед не влияет на исследованные показатели иммунного статуса.