Боковой амиотрофический склероз (БАС) – нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующей гибелью центральных и периферических двигательных нейронов коры больших полушарий, мозгового ствола и спинного мозга.

Этиология и патогенез заболевания окончательно не установлены, однако роль генетических мутаций в патологическом процессе в настоящее время не вызывает сомнений [1]. Известно, что в большинстве случаев БАС имеет спорадический характер, семейные случаи составляют около 5-10% [2]. Генетические исследования пациентов с БАС в настоящее время позволяют выявить мутантные гены в 68% семейных и 11% спорадических случаев БАС [3].

В европейской популяции наиболее часто выявляется экспансия гексануклеотидных GGGGCC-повторов в гене C9orf72 (число копий повторов более 30), что составляет до 40% семейных и 7% спорадических случаев БАС [4].

Экспансия гена атаксин-2 (ATXN2) более 33 копий CAG-повторов является молекулярно-генетической причиной спиноцеребеллярной атаксии II типа, а носительство аллелей этого гена с промежуточным числом копий CAG-повторов в диапазоне от 26 до 33 ассоциировано с развитием БАС [5; 6]. Согласно литературным данным данный тип мутации является неблагоприятным прогностическим маркером и характеризуется быстрым прогрессированием БАС [7; 8].

Цель исследования: оценить частоту встречаемости мутаций в генах С9orf72 и ATXN2 у пациентов со спорадической формой БАС, провести клинико-генетические сопоставления.

Материал и методы исследования

В исследовании участвовали 82 пациента со спорадической формой БАС, обратившихся в СЗГМУ им. Мечникова, НМИЦ им. В.А. Алмазова с целью диагностического поиска. Все пациенты удовлетворяли критериям El-Escorial, 2000 г. Также была отобрана контрольная группа (40 человек) без симптомов поражения двигательных нейронов. Исследуемые обеих групп проживали в Санкт-Петербурге и Ленинградской области и характеризовались этнической гетерогенностью.

У всех пациентов было получено информированное согласие.

Клинико-неврологический осмотр включал расчет индекса массы тела (ИМТ), так как прогрессирующая потеря массы тела характерна при БАС в связи с прогрессирующими атрофиями мышц, дисфагией и связана с неблагоприятным прогнозом.

При исследовании пациентов применялась функциональная шкала для оценки больных БАС ALSFRS-R, где 48 баллов – норма, а 0 – тяжелейшая инвалидизация больного. Выраженность дизартрии оценивали по шкале Hillel от 10 до 1 баллов, где 10 баллов – нормальная речь, 1 балл – отсутствие речи. Функцию внешнего дыхания исследовали с помощью спирометра MIR Spiridoc, оценивая жизненную емкость легких (ЖЭЛ). Данные исследования также повторили в динамике через 6 месяцев.

У всех пациентов и участников контрольной группы был проведен анализ количества GGGGCC-повторов в гене C9orf72, а также количества CAG-повторов в гене ATXN2. Экстракция ДНК проводилась с использованием набора QIAamp® DNA Mini Kit в соответствии с инструкцией производителя. Выявление экспансий в генах C9orf72 и ATXN2 проводили с использованием метода ПЦР с праймингом нуклеотидных повторов и с последующим разделением продукта реакции с помощью фрагментного анализа.   Последовательность используемых праймеров, условия ПЦР и подсчет   количества CAG-  и GGGGCC-повторов проводили в соответствии с ранее опубликованными протоколами [9; 10].

Молекулярно-генетические исследования проводились на базе Научно-методического центра молекулярной медицины Минздрава РФ лаборатории диагностики аутоиммунных заболеваний ПСПбГМУ им. И.П. Павлова.

Анализ данных проводился с использованием статистической программы IMB SPSS Statistics 20. Количественные данные представлены медианой (Me) и интерквартильным размахом (Q₁ – Q₃). Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Пациенты были распределены в соответствии с классификацией Хондкариана О.А. [11] по формам БАС. Отдельно выделялся вариант прогрессирующей мышечной атрофии (ПМА), входящий в группу болезней двигательного нейрона. Клиническая картина ПМА характеризовалась изолированным поражением периферического двигательного нейрона.

В исследовании участвовали по 24 пациента с бульбарной (БФ), шейно-грудной (ШГФ), пояснично-крестцовой (ПКФ) формами, 4 пациента – с первично-генерализованной (ПГФ), 1 пациент с высокой формой (ВФ) и 6 – с ПМА.

Лишь у двоих больных из 82 (2,4%) была обнаружена экспансия GGGGCC-повторов в гене C9orf72.

Особенностями первого случая было начало заболевания в 56-летнем возрасте с асимметричным поражением в дебюте заболевания (смешанный монопарез левой руки), стремительный темп прогрессирования, появление бульбарного синдрома спустя 7 месяцев от начала болезни, формирование смешанного тетрапареза с преобладанием симптомов поражения центрального двигательного нейрона (грубое повышение мышечного тонуса в руках и ногах), наличие распространенных мышечных фасцикуляций и выраженного болевого синдрома по типу артралгий (до 7 баллов по визуально-аналоговой шкале оценки боли) на стороне пареза.

Второй случай наблюдали у пациентки 60 лет, бульбарный сидром имел место уже в дебюте заболевания (нарушения речи по типу афонии и дизартрии) и быстро прогрессировал в виде появления через 5 месяцев дисфагии. При госпитализации в стационар выявляли признаки поражения центрального и периферического двигательного нейрона на трех уровнях в виде проявления псевдобульбарного, бульбарного синдромов, смешанного рефлекторного тетрапареза. Темп прогрессирования заболевания за период наблюдения оценивался как стремительный. В течение одного года от начала заболевания развилась полная анартрия, умеренная дисфагия, однако парезы скелетной мускулатуры нарастали медленно, пациентка продолжала себя обслуживать и питаться самостоятельно. В связи с выраженной дисфагией через 2 года от начала заболевания пациентке была выполнена плановая гастростомия.

Предэкспансия в гене ATXN2 была обнаружена у 8,5% (7) пациентов, из них 5 женщин и 2 мужчин. У 1 пациента была ПКФ, у 4 – ШГФ и у 2 – БФ. Ни у одного из пациентов с подтвержденными мутациями не был отягощен семейный анамнез.

В таблице 1 представлено распределение пациентов по формам БАС, участвовавших в исследовании.

Таблица 1

Характеристика форм БАС у пациентов, исследованных на носительство предэкспансии в гене ATXN2

Для клинико-генетического сопоставления пациенты были разделены на две группы:

1 группа – пациенты с отсутствием предэкспансии в гене ATXN2 (75 человек), 2 группа - пациенты с выявленной мутацией в гене ATXN2 (7 человек). Обоснованность сравнения параметров выборок пациентов с предэкспансией и без предэкспансии подчеркивается высокой статистической мощностью исследования (β = 1).

Медиана возраста больных на момент начала заболевания во 2 группе была выше, чем в 1, и составила 58,0 лет (Q₁=53, Q₃=63,5), против 55,0 лет (Q₁=49, Q₃=62), однако статистически значимых отличий не было определено (p=0,065).

В данных группах не было статистически значимых отличий по анамнестическим данным, подробнее в таблице 2. Медиана ИМТ до начала заболевания у пациентов 1 группы составляла 25,59 кг/м² (Q₁=23,65, Q₃=28,40), 2 группы - 27,47 кг/м² (Q₁=25,45, Q₃=30,47), (р=0,123). Длительность заболевания в 1 группе достигала 34,0 месяца (Q₁=25,0, Q₃=43,0), во 2 группе – 36,0 месяцев (Q₁=26,5, Q₃=40,0), (р=0,967).

На момент включения в исследование в данных группах не было статистически значимых отличий по шкале ALSFRS-R, шкале дизартрии Hillel и показателям ЖЭЛ.

Медиана оценки по шкале ALSFRS-R, отражающей функциональное состояние пациентов, в 1 группе составила 36,0 баллов (Q₁=29,50, Q₃=40,0), во 2 группе - 42,5 балла (Q₁=35,50, Q₃=45,50) (р=0,178).

Выраженность дизартрии в 1 группе оценивалась на 8,0 баллов (Q₁=6,0, Q₃=10,0), во 2 - 8,5 балла (Q₁=7,0, Q₃=10,0) (р=0,892).

Исследование ЖЭЛ на первом осмотре невозможно было провести 4 пациентам (троим из 2 группы и одной из 1 группы) в связи с наличием выраженной дыхательной недостаточности. Две пациентки находились на искусственной вентиляции легких (ИВЛ), двое использовали неинвазивную вентиляцию легких (НИВЛ) через лицевую маску более 10 часов в сутки. Уровень ЖЭЛ в 1 группе составил 87,0% (Q₁=69,50, Q₃=99,0), во 2 группе - 91% (Q₁=80,0, Q₃=103,50) (р=0,573).

ИМТ в группе пациентов с выявленной мутацией был статистически значимо выше, чем в группе без мутации, как при первом осмотре (р=0,048), так и в динамике через 6 месяцев (р=0,050).

К моменту повторного осмотра по причине летального исхода из исследования выбыло 5 пациентов из первой группы и 1 пациент из второй.

При повторном осмотре у пациентов 2 группы определялись более высокие показатели по шкале ALSFRS-R - 38,00 баллов (Q₁=31,00, Q₃=40,50), чем в первой группе – 27,0 баллов (Q₁=23,00, Q₃=32,50). Данные различия были статистически значимыми (р=0,038). Полученные результаты динамического наблюдения косвенно свидетельствуют о медленном нарастании функционального дефицита в данный отрезок времени у пациентов с предэкспансией по сравнению с группой пациентов без данного типа мутации. Однако небольшая выборка не позволяет сделать такое суждение.

Таблица 2

Клинические характеристики пациентов, исследованных на носительство предэкспансии в гене ATXN2

У троих пациентов (2 – ШГФ и 1 – БФ) с данным типом мутации темп прогрессирования заболевания оценивался как медленный, у остальных 4 пациентов – стремительный. Одна пациентка с БФ умерла через 23 месяца от начала болезни, пациент с ШГФ – через 30 месяцев. Пациентка с ПКФ была переведена на ИВЛ через 3 года от начала заболевания и к моменту окончания исследования находилась на ИВЛ в течение еще 3 лет.

У 75 пациентов (91,5%) количество GGGGCC-повторов составило 22-23, что соответствует допустимым значениям варианта нормы.

В контрольных образцах (40 здоровых добровольцев) предэкспансии GGGGCC-повторов в данном гене не было обнаружено.

Итак, частота встречаемости мутации гена ATXN2 в обследованной группе составила 8,5% случаев. Группа пациентов с выявленной предэкспансией в гене ATXN2 характеризовалась клинической гетерогенностью в виде различных форм БАС и различных темпов прогрессирования от медленного до стремительного. Выявлена тенденция к более старшему возрасту дебюта заболевания у пациентов с наличием данного типа мутации (p=0,065).

Экспансия гексануклеотидных GGGGCC-повторов в гене C9orf72 в нашем исследовании встречалась лишь у 2,4% пациентов, что значительно ниже этого показателя в сравнении с другими европейскими популяциями. Однако наши результаты не противоречат данным другого российского исследования, где этот тип мутации выявлялся в 3% случаев [12].

Заключение

Таким образом, в исследованной выборке пациентов предэкспансия гене ATXN2 более распространена, чем экспансия в гене C9orf72. Одно из российских исследований также показало, что мутация в гене ATXN2 у больных спорадическим БАС выявлялась чаще, чем в гене C9orf72: в 5% случаев против 1,8% [13].

Тем не менее молекулярно-генетическое исследование, а именно поиск мутаций в генах C9orf72 и ATXN2, является важным дополнением к клинической диагностике БАС, так как может позволить верифицировать диагноз на ранних стадиях БАС. Для определения значимых клинико-генетических корреляций необходимо дальнейшее накопление материала и исследование на большем количестве пациентов.