Поиск новых маркеров, позволяющих наиболее полно и в ранние сроки выявить особенности развития опухолевого процесса с возможностью в дальнейшем подобрать персонализированные подходы к терапии, является одной из актуальных задач современной онкологии. Метастазирование опухолей - многостадийный, мультифакторный, сложноорганизованный процесс. В реализации гематогенного и лимфогенного путей метастазирования особую роль отводят циркулирующим опухолевым клеткам (ЦОК, CTCs). ЦОК - клетки эпителиального происхождения, происходящие из клеток первичной опухоли и определяющиеся в периферической крови больных [1]. Кроме того, в ходе ряда модельных исследований выявлено, что эти клетки могут покидать опухоль на ранних стадиях ее развития [2]. По мнению некоторых авторов, количество и характеристика ЦОК могут выступать в качестве своеобразного инструмента, позволяющего оценивать опухолевую гетерогенность [3]. На экспериментальных моделях было установлено, что ежедневно в кровоток из 1 г опухолевой ткани поступает порядка 1 млн клеток, при этом только 1 клетка из 40 может достигнуть преметастатической ниши и только 0,01% клеток реализуются в гематогенные метастазы [4].

Наиболее полно изучены количественные значения циркулирующих опухолевых клеток у больных раком молочной железы (РМЖ), где их в крови у больных ранним (N0) РМЖ обнаруживаются в 30% случаев, у больных местнораспространенным (N+) раком – в 36%, а у больных метастатическим раком – в 70% случаев [5]. Однако механизмы, регулирующие особенности биологических свойств ЦОК, позволяющие небольшому количеству из них выжить и дать рост метастатическому очагу, до настоящего времени мало изучены. Предполагается, что покидающие опухолевый очаг клетки подвергаются обратимому эпителиально-мезенхимальному переходу, что сопровождается закономерным изменением их биологических свойств и обуславливает возможность находиться в циркуляторном русле. При этом в выживании и сохранении способности ЦОК давать новые опухолевые очаги особую роль отводят их взаимодействию с клетками крови – нейтрофилами, моноцитами и тромбоцитами [6].

В ряде экспериментальных работ показано, что в крови часть ЦОК способны образовывать кластеры, которые обуславливают образование метастатических очагов с большей вероятностью, чем индивидуальные ЦОК [7; 8]; это свидетельствует в пользу представлений об общности между циркулирующими и стволовыми опухолевыми клетками (ОСК). На кластеризующихся ЦОК повышена экспрессия такого маркера ОСК, как CD44, опосредующего взаимодействие клетки с межклеточным матриксом и выполняющего целый ряд функций, в том числе и регуляцию активности генома. Есть сообщения о том, что CD44⁺ ЦОК РМЖ обладают повышенной способностью к образованию поликлональных агрегатов, метастатическим и опухоль-инициирующим потенциалом [9].

По данным некоторых исследований, установлена взаимосвязь между содержанием ЦОК и эффективностью проводимой терапии. Оценка наличия или отсутствия ЦОК может быть использована для мониторинга у больных, получающих системную химиотерапию, и индивидуализированного планирования тактики лечения [10; 11].

В последние годы появляется все больше данных, посвященных взаимодействию ЦОК с иммунной системой опухоленосителей [12; 13]. В ходе проведенных в ФГБУ РНИОИ исследований [14] и другими авторами [15] была показана не только связь уровня ЦОК с некоторыми биологическими свойствами опухолей у больных раком легкого, но и выявлен ряд корреляций уровня ЦОК с показателями иммунного статуса, в частности с активированными Т-лимфоцитами, Т-клетками памяти, функционально активными NK-клетками.

Вопрос о возможности использования показателя ЦОК для прогнозирования эффективности лечения РМЖ остается открытым. Поскольку различные подтипы РМЖ имеют разное клиническое течение, в том числе и ответ на химиотерапию, не исключена и различная прогностическая и предиктивная роль ЦОК у больных люминальными и ТНРМЖ. Последнее АСКО сообщает об отсутствии прогностической значимости ЦОК у больных генерализованным РМЖ, находящихся на ХТ первой линии.

Таким образом, изучение количества ЦОК, их биологических свойств, характера взаимодействия с различными факторами циркуляторного русла представляет несомненный интерес для выявления взаимосвязи между их содержанием, особенностями протекания опухолевого процесса, формирования индивидуальных подходов к проводимой терапии и оценке ее эффективности.

Целью данной работы являлось выявление возможной прогностической значимости уровня ЦОК и их динамики при проведении химиотерапии больным с различными биологическими подтипами местнораспространенного РМЖ.

Материалы и методы исследования

Обследовано 42 пациентки с местнораспространённым раком молочной железы, HER2-негативным подтипом опухоли, IIIА, IIIВ, IIIС стадии, в возрасте от 30 до 65 лет, имеющих соматический статус по шкале ECOG-WHO от 0 до 2 баллов (по шкале Карновского от 100% до 80%). По биологическому подтипу больные распределились следующим образом: люминальный В подтип – 26 больных (62%), люминальный А подтип – у 5 больных (12% случаев). У 26% (11 пациенток) диагностирован тройной негативный вариант опухоли (ТНРМЖ). Все больные получали курсы ПХТ согласно клиническим рекомендациям МЗ РФ. Прогрессирование заболевания в течение 6-12 мес. отмечено у 16 больных, через 3 года – у 5 больных, 21 больная находится в ремиссии более 3 лет.

Биологические подтипы РМЖ, включая пролиферативную активность опухолей по экспрессии Ki-67, определяли в рамках стандартного диагностического ИГХ-исследования. Уровни ЦОК оценивали до начала и после 2-го курса химиотерапии (ХТ) с использованием системы CellSearch™ Veridex, Johnson & Johnson (США), с учетом морфологических характеристик и основанной на экспрессии маркеров адгезии эпителиальных клеток EpCAM, CD45 и цитокератинов 8, 18, 19, а также  HER2.

Статистическую обработку данных проводили с использованием статистического пакета STATISTICA 10 (StatSoft Inc., США).

Анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения проводили с применением критерия Шапиро-Уилка. Описательная статистика количественных признаков представлена в виде средней арифметической и стандартной ошибки средней арифметической (M±s). Достоверность отличий между выборками оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни (отличия считали достоверными при р<0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты определения уровня ЦОК до начала и после лечения у больных с РМЖ различных подтипов в связи с клиническим эффектом, оцениваемым по времени до прогрессирования, представлены в таблице 1.

Из представленных в таблице 1 результатов видно, что наименьшая пролиферативная активность (экспрессия ki-67) выявлена в опухолях с люминальным А подтипом РМЖ. В образцах опухоли РМЖ люминального В подтипа данный параметр был выше значений люминального А в 4 раза (на 290%) с колебанием от 10% до 95%.

Подтип ТНРМЖ характеризовался наиболее высоким уровнем пролиферативной активности, статистически значимо превышающей значения обоих люминальных подтипов. Напротив, время до прогрессирования опухоли было минимальным у больных с ТНРМЖ, достоверно отличаясь от показателя больных с люминальным А подтипом.

Наибольшее количество определяемых в крови ЦОК до лечения было характерно для пациенток с люминальными А и В подтипами РМЖ, причем интересной находкой, по-видимому, свидетельствующей о гетерогенности опухоли, оказалось выявление HER2⁺ статуса ЦОК в 19% случаев HER2^- люминального В подтипа. В группе пациенток с ТНРМЖ уровень ЦОК до проведения терапии был статистически достоверно ниже, чем группах люминального А и В подтипов РМЖ на 30% и 38% соответственно, а после лечения статистически достоверно превышал их.

Таблица 1

Сравнительная характеристика динамики уровней ЦОК и времени до прогрессирования заболевания у больных РМЖ различных подтипов

 (M±s, min – max)

р≤0,05;

* - по отношению к люминальному А РМЖ;

** - по отношению к люминальному В РМЖ.

После проведенного лечения количество ЦОК у больных люминальными А и В подтипами РМЖ имело тенденцию к снижению в первом случае и статистически достоверно уменьшалось во втором случае по сравнению с исходными значениями (р≤0,05). При этом средние значения ЦОК после лечения были выше в группе пациенток с люминальным А подтипом РМЖ, значение данного показателя в этой группе превышало количество ЦОК у пациентов с люминальным В подтипом опухоли на 40%. При ТНРМЖ проведение терапии не сопровождалось снижением количества ЦОК, а, напротив, отмечалось увеличение показателя на 50% по сравнению со значениями до начала терапии, что иллюстрирует известный факт наибольшей устойчивости данного подтипа к проводимой терапии.

Итак, несмотря на наименьший исходный уровень ЦОК при ТНРМЖ, пролиферативная активность в опухолях этого подтипа была максимальной. Отсутствие снижения количества ЦОК у больных данной группы при лечении ассоциировалось с уменьшением времени до прогрессирования заболевания. У больных с люминальным А и В подтипами РМЖ химиотерапия приводила к уменьшению числа ЦОК, что, наряду с более длительным бессобытийным периодом, чем при ТНРМЖ, может быть расценено как положительная динамика и свидетельствовать о благоприятном прогнозе. Интересно, что, несмотря на наиболее широкую индивидуальную вариабельность, отмеченную при люминальном В РМЖ, для показателей пролиферативной активности, исходного уровня ЦОК, бессобытийной продолжительности жизни больных, и объясняющуюся, по-видимому, его гетерогенностью, наиболее выраженное уменьшение числа ЦОК выявлено именно при этом подтипе.

В таблице 2 представлена динамика уровней ЦОК в зависимости от их исходного показателя при сравниваемых подтипах РМЖ.

Таблица 2

Распределение больных исследуемых групп по уровню ЦОК до и после лечения, % 

р≤0,05;

* - по отношению к люминальному А РМЖ;

** - по отношению к люминальному В РМЖ.

Как видно из таблицы 2, у пациенток с люминальным А подтипом РМЖ до проведения терапии ЦОК были выявлены у всех больных, причем преобладали варианты с множественным количеством (>3) ЦОК – 60% больных, у 20% выявлены единичные ЦОК и еще у 20% - 2-3 ЦОК. Проведение 2 курсов химиотерапии у этих больных сопровождалось уменьшением количества случаев с множественными ЦОК до 40%, увеличением количества ЦОК-негативных больных также до 40%. В группе с люминальным В подтипом РМЖ до лечения в 15% случаев ЦОК не определялись, еще у 15% выявлены единичные опухолевые клетки, одновременно с этим у 38% пациенток количество ЦОК составило 2-3 клетки, а более 3 ЦОК выявлено у 31% больных. После 2 курсов химиотерапии увеличилось количество больных люминальным В подтипом, в крови которых опухолевые клетки не определялись (до 46%), а количество пациенток с единичными, 2-3 и более 3 ЦОК – снизилось соответственно до 12, 27 и 15%. При ТНРМЖ до проведения терапии у 27% больных ЦОК не определялись, что было выше соответствующего показателя в группах с люминальным А и В подтипами РМЖ, единичные опухолевые клетки определялись в 9% случаев, 2-3 ЦОК выявлялись в 27% случаев, что достоверно выше на 35% данного показателя в группе с люминальным А и ниже на 29% в группе пациенток с люминальным В РМЖ. Более 3 ЦОК в данной группе до проведения лечения определялось у 36% пациенток, что достоверно ниже (на 40%) значений данного показателя при люминальном А подтипе РМЖ и несколько выше значений при люминальном В подтипе. Проведение химиотерапии способствовало 2-кратному снижению больных ТНРМЖ с количеством ЦОК>3, 3-кратному снижению - с уровнем ЦОК 2-3, нарастанию ЦОК-негативных случаев.

Итак, хотя проведение 2 курсов химиотерапии и сопровождалось нарастанием ЦОК-негативных случаев при всех подтипах, у части больных их количество оставалось без изменения, а у некоторых отмечено увеличение числа ЦОК. Результаты соотношения указанных типов реакции на лечение, а также число умерших представлены в таблице 3.

Таблица 3

Соотношение различных типов реакции на проводимое лечение у пациенток с различными подтипами РМЖ 

р≤0,05;

* - по отношению к люминальному А РМЖ;

** - по отношению к люминальному В РМЖ.

Как видно из таблицы 3, у пациенток с люминальным А подтипом РМЖ превалировали всего два варианта реагирования – снижение уровня ЦОК либо его увеличение, что наблюдалось в 40% случаев (табл. 3). В группах с люминальным В и ТНРМЖ наблюдаются все варианты ответа на терапию: в 54% случаев отмечается снижение ЦОК, в 15% (люминальный В) и 27% (ТНРМЖ) случаев количество опухолевых клеток в крови не изменяется; в 31% и 18% случаев для люминального В и ТНРМЖ соответственно наблюдается рост количества ЦОК.

Летальный исход отмечался у больных из групп люминального В и ТНРМЖ и составил соответственно 15% и 36% от общего числа больных. В группе с люминальным В РМЖ связи между изменением числа ЦОК и гибелью пациентки не выявлено. У 75% умерших пациенток отмечено снижение ЦОК в крови, причем в большинстве случаев исходно высокие количества ЦОК (>5) резко снижались до единичных клеток либо исчезали из циркуляции. При ТНРМЖ отмечается аналогичная зависимость: у 75% умерших пациенток наблюдалось снижение количества ЦОК после терапии, тогда как исходные уровни ЦОК у них составляли от единичных до >5 клеток. В 25% летальных случаев наблюдали выраженное увеличение количества ЦОК – от исходных 9 до 26 клеток, при этом летальный исход наблюдался в 2 раза чаще, чем возрастание уровня ЦОК (36% и 18% соответственно).

Результаты динамики уровней ЦОК у больных с различными подтипами РМЖ с разными сроками развития прогрессирования (раннее - 6-12 мес. и позднее - 3 и более лет) представлены в таблице 4.

Таблица 4

Динамика уровней ЦОК у больных раком молочной железы с последующим ранним и поздним прогрессированием

*- р≤0,05, по сравнению с значением до лечения.

Как видно из таблицы 4, у больных с обоими люминальными подтипами РМЖ с последующим развитием прогрессирования в течение 1 года отмечено статистически значимое снижение уровня ЦОК после 2 курсов химиотерапии по сравнению с исходным. В отличие от них у больных ТНРМЖ при раннем прогрессировании происходило нарастание этого показателя. У 30% пациенток с люминальным В подтипом РМЖ выявлены HER2⁺ ЦОК, у 90% таких больных наблюдался летальный исход. При ТНРМЖ выявлен выраженный рост количества ЦОК – на 206% по сравнению с исходными значениями, в 67% случаев с ранним прогрессированием наблюдали летальный исход.

У больных РМЖ всех исследованных подтипов с развитием длительной ремиссии (3 и более лет) после 2 курсов химиотерапии наблюдалось статистически достоверное снижение количества ЦОК по сравнению с исходными показателями, наиболее выраженное при люминальном В и ТНРМЖ.

Если при раннем прогрессировании отмечается связь динамики уровня ЦОК с пролиферативной активностью опухоли, то при развитии длительной ремиссии прогностическая значимость этого несомненно важного и часто используемого для прогностических целей показателя утрачивается: так, экспрессия Ki-67 у больных без прогрессирования в течение 3 и более лет оказалась в группах ТНРМЖ и люминального А подтипа выше, чем с прогрессированием в ранние сроки.

Заключение

При химиотерапии местнораспространенного РМЖ уровень ЦОК до лечения, по-видимому, не играет универсальной прогностической роли, т.к. при люминальном В подтипе он был выше у больных с ранним прогрессированием, а при люминальном А и при ТНРМЖ - у больных с поздним прогрессированием и развитием ремиссии свыше 3 лет. Однако при определении уровня ЦОК в динамике лечения были выявлены некоторые критерии, которые могут быть расценены как прогностические. Так, увеличение числа ЦОК у больных местнораспространенным ТНРМЖ после 2 курсов химиотерапии предполагает раннее прогрессирование и риск летального исхода в течение 1 года, а снижение уровня ЦОК говорит об эффективности проводимой химиотерапии и позволяет прогнозировать 3-летний и более длительный срок жизни. Для люминальных подтипов РМЖ динамика уровней ЦОК не показала прогностического значения. Тем не менее при люминальном В подтипе РМЖ даже при снижении общего уровня ЦОК наличие среди них HER2⁺ положительных при исходно HER2 опухоли может выступать в качестве прогностического фактора неэффективности лечения и риска раннего прогрессирования заболевания. Подобные наблюдения описаны в литературе [16]. По-видимому, в этих случаях целесообразно включать в лечение анти-HER2⁺-терапию, например герцептин.

Таким образом, прогностическая значимость динамики уровня ЦОК при химиотерапии местнораспространенного РМЖ зависит от подтипа опухоли и представляется наибольшей при ТНРМЖ и люминальном В подтипах.