Апоптоз, один из важнейших механизмов поддержания гомеостаза, осуществляется как в физиологических, так и в патологических условиях. В настоящее время проблеме апоптоза и его влиянию на течение и исход различных патологических процессов уделяется много внимания. Апоптоз характеризуется рядом характерных морфологических изменений в структуре клетки, а также рядом ферментзависимых биохимических процессов. В результате происходит элиминация клеток из организма с минимальным повреждением окружающих тканей. Нарушения в процессе апоптоза могут приводить к накоплению поврежденных клеток. Поэтому понимание путей апоптоза важно для разработки эффективной терапии при многих заболеваниях [1].

Семейство белков Bcl играет важную роль в регуляции апоптоза, и среди них есть как про-, так и антиапоптотические типы [2].

Белки семейства Bcl-2 признаны основными регуляторами митохондриального пути апоптоза. Они контролируют проницаемость наружной мембраны митохондрий. Кроме того, Bcl-2 белки также обнаружены в других внутриклеточных компартментах, таких как эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи, ядро, пероксисомы. На уровне этих органелл белки семейства Bcl-2 не только регулируют проницаемость наружной мембраны митохондрий удаленно, но также участвуют в основных клеточных процессах, включая гомеостаз кальция, контроль клеточного цикла и миграцию клеток. С развитием методов визуализации живых клеток и созданием флуоресцентных рекомбинантных белков стало ясно, что распределение белков Bcl-2 внутри клетки является динамическим процессом, на который глубоко влияют изменения в клеточном микроокружении. Высокодинамичный процесс внутриклеточного распределения белков семейства Bcl-2 является критическим для определения судьбы клетки [3, 4, 5]. Белки Bcl-2 функционируют посредством межбелковых взаимодействий. Воздействие на белки семейства Bcl-2 открывает новые возможности воздействия на патологические процессы [6].

Поскольку семейство белков Bcl2 является ключевым регулятором апоптоза, нарушения его функций способствуют развитию многих заболеваний, включая рак, нейродегенеративные расстройства и аутоиммунные заболевания [7].

Апоптоз также играет решающую роль в репаративных процессах регенерации. В частности, контроль над плотностью клеток в ткани, образующейся в месте заживления раны, опосредуется апоптозом [8-10].

Цель работы: изучить экспрессию белков семейства Bcl в условиях повреждения брюшины при естественном течении процесса и при блокаде р38 МАРК.

Материал и методы исследования

В качестве модели спаечного процесса в брюшной полости использовали самцов крыс линии Вистар [11, 12]. Представителям контрольной группы (N=40) был введен в брюшную полость физиологический раствор (3 мл), представителям опытной группы (N=40) – препарат «Серогард»® того же объема (АО «Фармасинтез», Россия, товарный знак (знак обслуживания) № 529254 «СЕРОГАРД»). Фармакодинамическим эффектом препарата «Серогард»® является пролонгированная блокада активности p38 MAPK (митогенактивируемой протеинкиназы) [13].

Все исследования проведены с соблюдением этических норм. Исследование одобрено комитетом по этике Иркутского научного центра хирургии и травматологии.

Исследования проводили на 8 временных точках в сроки от 2 часов до 30 суток. Проводили иммуногистохимическое окрашивание образцов. В ходе исследования применяли:

– антитела к Bcl2 rabbit polyclonal (Abbiotec Cat. № 250555, Lot 09110202) в рабочем разведении 1:300 (исследование антиапоптоза);

– Bclx rabbit monoclonal (Epitomics, Cat. № 1018-3, Lot E-07-12-01) в рабочем разведении 1:100 (исследование проапоптоза).

Для математической оценки интенсивности апоптоза и антиапоптоза производили подсчет количества окрашенных Bclx и Bcl2 клеток по отношению к неокрашенным. Определяли медиану, 25%-ный и 75%-ный квартили.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами произведены подсчет процента окрашенных на Bclx и Bcl2 клеток и сравнение интенсивности окрашивания внутри основной и контрольной групп, а также между ними.

Таблица 1

Окраска на Bcl2 и Bclx клеток внутри основной и контрольной группы

Как следует из таблицы 1, в контрольной группе экспрессия проапоптозных и антиапоптозных белков первые часы течет параллельно. К 12, 24 часам экспрессия Вcl2 интенсивнее, чем Bclx. К 14-м суткам экспрессия Bclx и Bcl2 максимальная, а к 30-м суткам экспрессия Bclx в области формирования спайки высокая и значимо отличается от Bcl2 (рис. 1).

Рис. 1. Интенсивность окраски Bclx и Bcl2 клеток контрольной группы

В контрольной группе к 6 часам экспрессия Bcl2 выше, а к 12, 24 часам, наоборот, экспрессия Bclx значительнее, чем Bcl2. К 3-м суткам интенсивность окраски на Bclx уменьшается вдвое, но все же выше, чем Bclx. На 14-е сутки окраска на Bcl2 и Bclx минимальная и сохраняется такой до 30 суток (рис. 2).

Рис. 2. Интенсивность окраски Bclx и Bcl2 клеток в основной группе

Закономерности экспрессии Bcl2 и Bclxl клеток при сравнении между основной и контрольной группами представлены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнение интенсивности окраски Bclx и Bcl2 клеток между группами

Как следует из таблицы 2, экспрессия Bcl2 увеличивается первые 6 часов в основной группе, в 12–24 часа значимо ниже, чем в контрольной группе, а в 3-и и 14-е сутки значительно ниже, чем в контрольной группе (рис. 3).

Рис. 3. Окраска на Bcl2 в основной и контрольной группах

Экспрессия Bclx значительно увеличивается к 3-м суткам в контрольной группе с максимумом интенсивности к 14-м и 30-м суткам по сравнению с основной группой (рис. 4).

Рис. 4. Окраска на Bclx в основной и контрольной группах

Таким образом, в ходе исследования показано, что при экспериментальном повреждении брюшины запускаются как апоптоз, и антиапоптоз. В ранние сроки после повреждения брюшины превалирует окраска на маркеры антиапоптоза – до 3 суток, позднее на первый план выходят процессы апоптоза. Наиболее явно различия определяются к концу наблюдения – на 30-е сутки. За счет механизмов запуска апоптоза элиминируется большая популяция клеток фибробластического ряда из зоны повреждения брюшины [14, 15]. При этом окраска на выявление маркеров антиапоптоза в ткани имеет двухволновый характер с максимальной выраженностью на 1–3-и сутки и 14-е сутки процесса. Данные сроки совпадают с периодом роста грануляционной ткани (3-е сутки) и процессом ее созревания (14-е сутки). На финальной точке наблюдения (30-е сутки) количество клеток, демонстрирующих экспрессию антиапоптозных белков, резко снижается (рис. 5).

Рис. 5. Процессы апоптоза и антиапоптоза после травматического повреждения брюшины

Выводы

Нами установлено, что применение Серогарда® при экспериментальном спаечном процессе приводит к активации апоптоза фибробластов в зоне репарации. Указанный механизм действия может предопределить снижение спайкообразования в зоне травмы брюшины.