Индивидуализация лечебно-восстановительных мероприятий при нейродегенеративных и ишемических повреждениях центральной нервной системы в последние годы приобретает особое значение. Такие индивидуальные особенности, как стрессоустойчивость и уровень когнитивных способностей, перекочевали из разряда диагностируемых величин в область факторов риска. Современные исследования демонстрируют тесную взаимосвязь состояния когнитивной функции с выраженностью оксидантного стресса [1]. Физическая нагрузка является неотъемлемым компонентом реабилитационных мероприятий при церебральной гипоперфузии, характерной для подавляющего числа цереброваскулярных заболеваний. Предполагается, что улучшение когнитивных функций под ее воздействием связано с высвобождением нейротрофического фактора мозга (BDNF) из церебральных эндотелиальных клеток под воздействием окислительного стресса [2]. Следует отметить, что высвобождение BDNF под влиянием физических нагрузок имеет ряд индивидуальных особенностей: величина этих эффектов у женщин ниже по сравнению с мужчинами [3].

Цель нашего исследования – выявить особенности протекания оксидантного стресса при экспериментальной церебральной гипоперфузии и моделировании реабилитационных мероприятий в зависимости от способности животных к обучению.

Материал и методы исследования

Эксперимент проводился на 240 крысах Wistar (120 самцов и 120 самок). Исследование одобрено Этическим комитетом ФБОУ ВО «ЯГМУ» Минздрава России (протокол № 8 от 24.03.2016 г.) и выполнен в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г., а также ее пересмотренным вариантом 2000 г. и Приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Билатеральная окклюзия обеих общих сонных артерий под внутрибрюшинным наркозом золетилом была использована в качестве модели хронической церебральной гипоперфузии. Накануне оперативного вмешательства животных тестировали в водном лабиринте Морриса для оценки уровня когнитивных способностей[4]. По результатам тестирования крысы обоего пола были разделены на две подгруппы: с высоким уровнем когнитивных способностей (ВУК) и низким уровнем развития когнитивных способностей (НУК). Впоследствии прооперированные крысы сформировали группу сравнения (128 животных, из которых 64 – животные с ВУК, и 64 – животные с НУК) и экспериментальную группу (112 животных), также включающую в себя одинаковое количество животных с ВУК и с НУК. Животные экспериментальной группы, начиная с 7-х суток после операции, ежедневно подвергались плаванию в бассейне в течение 15 минут на протяжении 4 недель, то есть спустя 35 дней после операции физические нагрузки прекращались.

Концентрацию ТБК активных продуктов (малонового диальдегида – МДА) в плазме крови определяли спектрофотометрически. Концентрацию L-цитруллина (LC) и суммарную концентрацию нитрит- и нитрат-ионов (NО)-Х плазмы крови использовали для оценки эндогенной продукции оксида азота. Определение концентрации (LC) в плазме крови проводили по методике, основанной на реакции остатков LC с диацетилмоноксимом и оксидом железа (III) в кислой среде. Интенсивность окислительного стресса оценивали по антиоксидантной активности плазмы крови путем индуцирования в ней хемилюминесценции пероксидом водорода с сульфатом железа по стандартной методике на приборе БХЛ 07. Определяли: I max (мВ) – максимальную интенсивность свободнорадикальных процессов, за все время измерения; S (мВ×с) – светосумму; tgα (мВ/с). Все вышеперечисленные исследования выполняли у интактных животных, а также через 1, 6, 8, 14, 28, 35, 60 и 90 суток после операции в экспериментальной группе и группе сравнения. Статистический анализ первичных данных был проведен с использованием программного пакета StatSoft Statistica v 10.0. Значимость различий измеряемых параметров оценивали с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни для двух независимых выборок. Между средними значениями исследуемых групп и подгрупп рассчитывался коэффициент корреляции Пирсона.

Результаты исследования и их обсуждение

Полученные данные в группе сравнения характеризуются стадийностью. В первые сутки исследования, спустя 24 часа после моделирования церебральной гипоксии, достоверная динамика большинства показателей отмечена только в подгруппе животных с низким уровнем когнитивных способностей: МДА, LC – достоверно возрастают; (NO)-X, Imax, tgα, S – достоверно снижаются (табл. 1).

Таблица 1

Динамика LC и NO-X в эксперименте

Примечание. * - p<0,05 по отношению к контрольным значениям; # - p<0,05 по отношению к значениям группы сравнения.

Изменения со стороны животных с ВУК касаются только: (NO)-X – рост и S – снижение. В дальнейшие сроки исследования в подгруппе НУК достоверное снижение сохраняется, начиная с 14, 21 суток исследования: (NO)-X до 28 суток, Imax, tgα, S сохраняется до 35 суток исследования, МДА – до 60-х суток эксперимента (табл. 2).

Таблица 2

Динамика tgα и S в эксперименте

Примечание. * - p<0,05 по отношению к контрольным значениям; # - p<0,05 по отношению к значениям группы сравнения.

У животных с ВУК изменения параметров менее выражены: статистически значимо высокие значения NO-X сохраняются только на 14-е сутки исследования, а сниженные по отношению к контрольным показателям значения S – на протяжении 14, 21, 28, 35 суток после операции. Кроме того, в подгруппе животных с ВУК на 28-е сутки исследования статистически значимо возрастает tgα и Imax. Поздние сроки после операции, после предшествующей стабилизации большинства показателей на цифрах, близких к значениям интактных животных, характеризуются повторным нарастанием изменений, во многом повторяющих динамику ранних сроков после операции.

В подгруппе НУК 60-е и 90-е сутки исследования отмечены ростом LC по отношению к показателям интактных животных, которому предшествует значительный достоверный рост (NO)-X на 28-е сутки исследования, который на 90-е сутки сменяется снижением ниже показателей интактных животных. Также на 90-е сутки в этой подгруппе достоверно возрастает МДА, другие показатели от показателей интактных животных достоверных отличий не имеют (табл. 3). В подгруппе с ВУК 60-е сутки также отмечены достоверным ростом LC по отношению к показателям интактных животных, которому предшествует значительный рост (NO)-X на 28-е сутки исследования. Однако в отличие от НУК этот рост менее выражен и на 60-е и 90-е сутки сменяется более значительным снижением (NO)-X, ниже показателей интактных животных. Так же как и в подгруппе НУК, на 90-е сутки у животных с ВУК достоверно возрастает МДА.

Таблица 3

 Динамика МДА и Imax в эксперименте

Примечание. * - p <0,05 по отношению к контрольным значениям; # - p <0,05 по отношению к значениям группы сравнения.

При воздействии 15-минутной ежедневной физической нагрузки в экспериментальной группе (8-е сутки исследования) снижение S отмечается в обеих подгруппах. Это достигается альтернативными вариантами изменений оксидантного профиля. В подгруппе животных с НУК по отношению к показателям группы сравнения отмечен статистически значимый рост LC, снижение tgα, МДА, Imax. В подгруппе животных с ВУК повышается (NO)-X и МДА. Статистически значимое снижение S относительно показателей группы сравнения в обеих экспериментальных подгруппах сохраняется только в первые сутки влияния физической нагрузки. В дальнейшем достоверные отклонения S характерны только для подгруппы животных с НУК: в 14-е сутки эксперимента она еще остается сниженной по отношению к показателям группы сравнения, а на 21, 28, и 35-е сутки исследования статистически значимо превышает показатели группы сравнения. Аналогичный рост S в подгруппе животных с ВУК отмечен только на 35-е сутки исследования. Также в обеих подгруппах на 21-е сутки исследования отмечен достоверный рост LC и Imax.

На 35-е сутки в обеих подгруппах значительно достоверно снижен (NO)-X, особенно в подгруппе с НУК. Фактически ежедневное влияние кратковременной нагрузки выравнивает динамику этого показателя, который в группе сравнения принимает максимальные значения за все время эксперимента. На 35-е сутки эксперимента достоверно увеличен по отношению к показателям группы сравнения tgα, однако в подгруппе животных с ВУК отмечен только на 35-е сутки исследования, за этим подъемом на 60-е сутки следует достоверное снижение указанного параметра, чего не наблюдается в подгруппе животных с НУК. Спустя 90 суток исследования МДА и (NO)-X статистически значимо снижены в обеих изучаемых подгруппах, однако значения показателя LC аналогичны таковому группы сравнения. Этому снижению на 60-е сутки исследования у животных с ВУК предшествует достоверный рост (NO)-X, а у животных с НУК – снижение. Также на 60-е сутки исследования по отношению к показателям группы сравнения в обеих подгруппах животных статистически значимо снижено S и Imax. Для подгруппы животных с ВУК характерен существенный рост tgα на 35-е сутки с последующим снижением на 60-е по отношению к показателям группы сравнения.

Проведенный корреляционный анализ в нашем исследовании выявил сильную положительную связь динамики маркеров перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) как у крыс с ВУК (S и tgα, 0,99), так и у крыс НУК (I max и tgα, 1,00; S и Imax, 0,95; S и tgα, 0,95). Сильная положительная корреляционная связь между МДА и показателями ПОЛ и АОС проявляется только при физической нагрузке у крыс с низким уровнем когнитивных способностей (МДА и Imax, 0,68; МДА и tgα, 0,69; МДА и S, 0,67). Статистически значимая отрицательная связь между содержанием нитритов и интенсивностью ПОЛ (NO-X и S, -0,64) отмечается в группе сравнения крыс с ВУК. Статистически значимая сильная отрицательная корреляционная связь между содержанием цитруллина – продукта NOS-реакции и нитритов (LC и NO-X, -0,7) у крыс с ВУК при физической нагрузке свидетельствует о возможном ингибировании продукции NO в ходе NOS-реакции и активации нитритредуктазной компоненты цикла окиси азота.

Статистически значимая отрицательная связь между (NO)-X и I max в группе сравнения крыс с ВУК, по-видимому, свидетельствует о его нейропротективном действии, так как известны антиоксидантные свойства оксида азота, которые препятствуют процессам перекисного окисления липидов, в частности нейтрализуя супероксид-аниона. Статистически значимых положительных корреляционных связей между показателями обмена оксида азота и свободнорадикальных процессов у крыс с НУК не наблюдалось ни в отсутствии физической нагрузки, ни с физической нагрузкой. Это, по-видимому, свидетельствует об отсутствии компенсаторного действия оксида азота, что подтверждается результатами увеличения МДА, т.е. развития окислительного стресса в этой группе.

Статистически значимая отрицательная зависимость между содержанием цитруллина - продукта NOS-реакции и нитритов у крыс с ВУК при физической нагрузке свидетельствует о возможном ингибировании продукции NO в ходе NOS-реакции и активации нитритредуктазной компоненты цикла окиси азота. В ранний период церебральной гипоперфузии усиленное образование NO может соответствовать адаптационно-компенсаторным механизмам в нейронах, направленным на использование его в качестве протектора гипоксии. Цикл окиси азота обеспечивает не только генерацию NO, но и эффективную элиминацию высокореакционноспособных свободнорадикальных соединений при помощи превращения в менее активные вещества, например в нитрит- и нитрат-ионы. Вместе с тем существует опасение, что при церебральной гипоксии увеличение акцептирования электронов ионами NO2- с цепи переноса электронов может усугубить нарушение окислительных энергетических процессов, превращая компенсаторный механизм в патологический [5].

В наших исследованиях ВУК у животных был ассоциирован с большим повреждением структур нейроглиального ансамбля после двусторонней перевязки обеих сонных артерий [6], а также с большей смертностью [7]. Выше показано, что у животных с ВУК существует сопряженность между интенсивностью перекисного окисления липидов и уровнем нитратов (отрицательная корреляционная связь), это позволяет предположить связь гибели животных с ВУК с экспрессией NO-синтазы, рост активности которой, как и смертность, приходится на 3-4 неделю развития церебральной гипоперфузии [8].

Полученные нами данные позволяют предполагать большую эффективность коррекции последствий когнитивного снижения при церебральной гипоперфузии донаторами азота  у пациентов с высоким уровнем когнитивных функций. Вместе с тем у пациентов с низкими исходными показателями когнитивных функций более эффективными могут оказаться антиоксиданты. Продемонстрированные выше закономерности, полученные в нашем исследовании на животных, для успешного внедрения в практику требуют дальнейших клинических исследований.

Заключение

Физические нагрузки при гипоксии мозга у крыс с НУК приводят к окислительному стрессу. Продукция оксида азота у крыс с ВУК в условиях гипоксии носит компенсаторный нейропротективный характер. Активация нитритредуктазной компоненты цикла окиси азота при физических нагрузках у животных с ВУК является, по-видимому, локальной стресс-лимитирующей реакцией в условиях гипоксии мозга.